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蜡样芽孢杆菌胶原蛋白酶基因的异源表达与活性分析

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中国食品学报 2020年第1期20卷 69-75页

作者：刘丽莉杨陈柳尤晓颜李玉梁严予河南科技大学食品与生物工程学院河南洛阳471023 食品加工与安全国家级教学示范中心河南洛阳471023

研究采用降解骨胶原蛋白的蜡样芽孢杆菌MBL13-U作为原菌种,并对蜡样芽孢杆菌MBL13-U进行全基因组测序,克隆获得胶原蛋白酶(ColM13)基因。将目的基因与大肠杆菌的表达载体pET30a进行连接,转入大肠杆菌宿主菌株BL21,获得降解骨胶原蛋白的... 详细信息

研究采用降解骨胶原蛋白的蜡样芽孢杆菌MBL13-U作为原菌种,并对蜡样芽孢杆菌MBL13-U进行全基因组测序,克隆获得胶原蛋白酶(ColM13)基因。将目的基因与大肠杆菌的表达载体pET30a进行连接,转入大肠杆菌宿主菌株BL21,获得降解骨胶原蛋白的工程菌pET30a-ColM13/BL21。通过SDS-PAGE测定异源表达的重组蛋白酶ColM13的分子质量,并测定不同诱导时间和诱导浓度对ColM13酶活性的影响,最终确定重组蛋白酶ColM13的酶活最适条件:6‰异丙基硫代半乳糖苷(IPTG,100 mmol/L),37℃诱导6 h,优化后酶活力最高为64.99 U/mL,较优化前提高4.24倍。通过水解圈试验、紫外光谱和扫描电子显微镜等方式验证,表明工程菌构建成功,这为我国畜禽骨骼资源的深度开发和综合利用提供了新的研究思路。

关键词：蜡样芽孢杆菌MBL13-U 胶原蛋白酶大肠杆菌异源表达活性分析

非洲猪瘟病毒A151R蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达及鉴定

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中国动物传染病学报 2022年第2期30卷 142-146页

作者：李鹏昊刘鹏吴芃梁严予关洋李向东逄文强田克恭国家兽用药品工程技术研究中心洛阳471003

非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的一种高致死性传染病,对养猪业危害巨大。为了提供有效的抗原蛋白用于ASFV的临床诊断及免疫预防研究,本试验将ASFV SY18株A151R蛋白的基因序列进行密码子优化,并克隆至pET28a载体,双酶切验证得到大... 详细信息

非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的一种高致死性传染病,对养猪业危害巨大。为了提供有效的抗原蛋白用于ASFV的临床诊断及免疫预防研究,本试验将ASFV SY18株A151R蛋白的基因序列进行密码子优化,并克隆至pET28a载体,双酶切验证得到大小分别为450 bp和5300 bp的片段,验证重组载体正确。重组载体pET28a-A151R转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,添加pG-Tf2载体以提供伴侣分子帮助目的蛋白折叠,并通过摇瓶发酵考察目的蛋白的表达。SDS-PAGE与Image-Pro Plus软件分析结果表明,A151R蛋白可实现65.4%的可溶性表达,蛋白分子量大小为17 kDa,利用亲和层析纯化所得目的蛋白纯度达到97.4%。Western blot结果显示,A151R蛋白可被ASFV阳性血清识别,表明其反应性良好。本研究首次实现A151R蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达,为ASFV诊断及其疫苗的研究提供了较好的候选抗原蛋白。

关键词：非洲猪瘟 A151R蛋白可溶性表达 Western blot

牛骨血管紧张素转化酶抑制肽发酵动力学及结构与特性分析

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食品科学 2017年第2期38卷 52-58页

作者：刘丽莉李丹尹光俊梁严予康怀彬河南科技大学食品与生物工程学院河南洛阳471003

前期筛选蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus MBL13-U),结合嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus,St)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum,Lp)混合发酵牛骨粉制备血管紧张素转化酶(angiotensin converting enzyme,ACE)抑制肽,对其发酵动力学进行研究,采用Logistic和Luedeking-Piret等方程对发酵过程进行非线性拟合,建立发酵过程中菌体生长、产物生成、基质消耗动力学模型,拟合度均高于0.97。通过扫描电镜、紫外扫描、差示扫描量热仪对ACE抑制肽进行结构表征。结果表明,由于牛骨ACE抑制肽具有良好的吸湿性,其在扫描电镜下表面出现明显的沟壑痕迹;在222 nm波长处出现强吸收峰,符合胶原多肽的特征吸收;与牛骨胶原蛋白相比,其热变性温度升高,热稳定性较强。同时对其特性分析表明,牛骨ACE抑制肽具有较好的溶解性、较强的耐酸碱性,在0.9 mol/L以内的NaCl浓度条件下耐盐性较强,胃肠道酶对牛骨ACE抑制肽的影响较小。

关键词：蜡样芽孢杆菌牛骨血管紧张素转化酶抑制肽发酵动力学结构表征特性

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卵白蛋白肽的磷酸化改性工艺优化

河南科技大学学报（自然科学版） 2017年第3期38卷 69-73页

作者：刘丽莉李玉梁严予李丹杨陈柳河南科技大学食品与生物工程学院河南洛阳471023

在试验确定酶解制备卵白蛋白肽的最优工艺条件基础上,对酶解后鸡蛋清卵白蛋白肽磷酸化改性工艺进行了研究。以磷酸化程度为指标,确定最佳磷酸盐为三聚磷酸钠。通过单因素和四元二次正交旋转组合试验,研究了磷酸化工艺,确定最优工艺条件... 详细信息

在试验确定酶解制备卵白蛋白肽的最优工艺条件基础上,对酶解后鸡蛋清卵白蛋白肽磷酸化改性工艺进行了研究。以磷酸化程度为指标,确定最佳磷酸盐为三聚磷酸钠。通过单因素和四元二次正交旋转组合试验,研究了磷酸化工艺,确定最优工艺条件组合为:反应温度30℃、p H值8.0、反应时间4 h、三聚磷酸钠添加量(质量分数)9%,在此条件下磷酸化程度可达到(57.27±1.68)mg/g。通过紫外光谱扫描,对磷酸化改性的卵白蛋白肽进行结构变化分析。研究结果表明:磷酸化改性的卵白蛋白肽的紫外吸收峰发生了红移,卵白蛋白分子的有序二级结构减少。由于磷酸基团的嵌入,卵白蛋白肽的结构发生了变化,使得磷酸化改性后的卵白蛋白肽的紫外最大吸收峰增强。

关键词：卵白蛋白肽磷酸化工艺优化

混合菌种发酵牛骨粉制备血管紧张素转换酶抑制肽

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河南科技大学学报（自然科学版） 2017年第1期38卷 67-72,7-8页

作者：刘丽莉梁严予尹光俊李丹杨陈柳河南科技大学食品与生物工程学院河南洛阳471023

利用蜡样芽孢杆菌(***)MBL 13-U、植物乳杆菌(Lp)和嗜热链球菌(St)混合发酵牛骨粉,制备牛骨血管紧张素转换酶(ACE)抑制肽。通过正交试验,以胶原多肽质量浓度为指标,确定最佳菌种体积比为V(*** MBL 13-U)∶V(Lp)∶V(St)=1∶1∶1,蔗糖添加... 详细信息

利用蜡样芽孢杆菌(***)MBL 13-U、植物乳杆菌(Lp)和嗜热链球菌(St)混合发酵牛骨粉,制备牛骨血管紧张素转换酶(ACE)抑制肽。通过正交试验,以胶原多肽质量浓度为指标,确定最佳菌种体积比为V(*** MBL 13-U)∶V(Lp)∶V(St)=1∶1∶1,蔗糖添加量(质量分数)为2.5%,骨粉添加量(质量分数)为3.5%。在单因素试验基础上采用中心组合试验设计,以ACE抑制率为指标,确定最佳发酵工艺条件:接种量(质量分数)为4%,发酵温度为37℃,发酵时间为42 h,发酵液初始p H值为7.0。经验证试验,在最佳发酵条件下,多肽液的ACE抑制率最高为(51.73±0.65)%。针对牛骨ACE抑制肽的特性,得到混合菌种发酵牛骨粉的最佳工艺参数。

关键词：混合菌种发酵牛骨ACE 胶原多肽

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微生物发酵法制备牛骨抗菌肽的工艺条件优化

河南科技大学学报（自然科学版） 2018年第6期39卷 72-78页

作者：刘丽莉梁严予孟圆圆代晓凝陈珂河南科技大学食品与生物工程学院河南洛阳471023

为从牛骨中提取出抗菌肽以及探究发酵过程的最优工艺条件,以牛骨为原料,采用混合发酵法制备牛骨抗菌肽。混合发酵的菌株选用嗜酸乳杆菌(LA)、嗜热链球菌(ST)和经筛选安全无毒的蜡样芽孢杆菌(BC MBL13-U)。通过正交试验,以胶原多肽质量... 详细信息

为从牛骨中提取出抗菌肽以及探究发酵过程的最优工艺条件,以牛骨为原料,采用混合发酵法制备牛骨抗菌肽。混合发酵的菌株选用嗜酸乳杆菌(LA)、嗜热链球菌(ST)和经筛选安全无毒的蜡样芽孢杆菌(BC MBL13-U)。通过正交试验,以胶原多肽质量浓度为指标,确定最优培养基组分为:菌种配比V(BC MBL13-U)∶V(LA)∶V(ST)=1∶2∶1,蔗糖添加量(质量分数)2.0%,骨粉添加量(质量分数)4.0%。在正交试验基础上采用中心组合设计试验,以抑菌率作为指标,确定最优发酵工艺条件为:接种量(质量分数)4%,发酵温度38℃,发酵时间40 h,初始p H 7.0。经验证试验,在最优发酵工艺条件下,多肽液的抑菌率最高为(95.03±0.55)%。抑菌试验结果表明:牛骨抗菌肽对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都有明显抑制作用。

关键词：混合菌种发酵牛骨抗菌肽胶原多肽抑菌率

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*** MBL13-U产牛骨胶原蛋白酶工艺优化

河南科技大学学报（自然科学版） 2018年第1期39卷 68-72,8-9页

作者：刘丽莉李丹杨陈柳梁严予李玉河南科技大学食品与生物工程学院河南洛阳471023

为了获得能够高效降解牛骨胶原蛋白的新型胶原蛋白酶,以蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus MBL13-U)为出发菌种,以胶原蛋白酶活力为检测指标,对影响发酵的4个因素(菌种接种量、发酵温度、p H、发酵时间)进行单因素试验。通过四元二次正交旋... 详细信息

为了获得能够高效降解牛骨胶原蛋白的新型胶原蛋白酶,以蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus MBL13-U)为出发菌种,以胶原蛋白酶活力为检测指标,对影响发酵的4个因素(菌种接种量、发酵温度、p H、发酵时间)进行单因素试验。通过四元二次正交旋转组合试验,确定了*** MBL13-U菌株发酵制备胶原蛋白酶的最佳工艺。当菌种接种量4%(体积分数)、发酵温度35℃、初始p H6.4、发酵时间46 h时,胶原蛋白酶活力达(92.31±1.13)U/m L。将其作用于牛骨胶原蛋白,通过扫描电子显微镜对酶解过程中的牛骨胶原蛋白进行结构分析。分析结果表明:酶解破坏了牛骨胶原蛋白原本完整的表面结构,使其所含的Ⅰ型胶原蛋白更多地暴露在表面,加快水解。

关键词： Bacillus cereus MBL13-U 发酵胶原蛋白酶工艺优化牛骨胶原蛋白

猪圆环病毒2型病毒样颗粒的高效组装技术研究

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中国生物工程杂志 2020年第11期40卷 35-42页

作者：王彦伟李鹏昊梁严予关洋逄文强田克恭国家兽用药品工程技术研究中心洛阳471000

目的:探索猪圆环病毒2型(PCV2)病毒样颗粒(VLPs)的高效组装技术,提高VLPs的稳定性。方法:利用大肠杆菌表达PCV2 Cap蛋白自组装为VLPs,分析不同离子强度下VLPs的稳定性。利用切向流技术添加尿素,降低p H,可使VLPs解组装,利用硫酸铵分级... 详细信息

目的:探索猪圆环病毒2型(PCV2)病毒样颗粒(VLPs)的高效组装技术,提高VLPs的稳定性。方法:利用大肠杆菌表达PCV2 Cap蛋白自组装为VLPs,分析不同离子强度下VLPs的稳定性。利用切向流技术添加尿素,降低p H,可使VLPs解组装,利用硫酸铵分级沉淀、阴离子交换层析纯化获得Cap蛋白,去除尿素,提高离子强度和pH,实现VLPs的高效再组装。结果:PCV2 Cap蛋白自组装VLPs在150mmol/L NaCl下稳定性较差,而在500mmol/L NaCl下可提高VLPs的稳定性,但仍较易发生聚集,核酸含量均较高。在150mmol/L NaCl、300mmol/L尿素和p H 5.5的缓冲体系条件下,能够使VLPs解组装。经25%~50%饱和硫酸铵(V/V)分级沉淀粗纯,阴离子交换层析500mmol/L NaCl下洗脱获得精纯Cap蛋白,蛋白质纯度≥95%,并能够有效去除核酸。通过切向流技术去除体系中的尿素,并将NaCl浓度提高至1mol/L、p H提高至8.0,改变蛋白质表面静电荷分布,实现VLPs的高效、均一再组装,组装效率≥99%,回收率为65.85%,并明显提高VLPs的稳定性,能够稳定保存6个月以上。结论:利用硫酸铵分级沉淀、阴离子交换层析纯化获得Cap蛋白,去除尿素,提高离子强度和p H,实现VLPs的高效再组装。

关键词：猪圆环病毒2型病毒样颗粒切向流技术高效组装稳定性

重组胶原酶Bacillus cereus ColM13的酶学及结构特性分析

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食品与发酵工业 2018年第5期44卷 16-21页

作者：刘丽莉杨陈柳李玉梁严予孟圆圆代晓凝陈珂河南科技大学食品与生物工程学院河南洛阳471023

以前期成功构建出降解胶原蛋白的工程菌pET30a-ColM13/BL21为出发菌,对工程菌表达纯化出的重组胶原酶(ColM13)的酶学性质进行分析。通过研究温度、pH、抑制剂对其的影响,得出ColM13的最适反应温度为50℃,最适反应pH为8.0;在20~55℃和pH6... 详细信息

以前期成功构建出降解胶原蛋白的工程菌pET30a-ColM13/BL21为出发菌,对工程菌表达纯化出的重组胶原酶(ColM13)的酶学性质进行分析。通过研究温度、pH、抑制剂对其的影响,得出ColM13的最适反应温度为50℃,最适反应pH为8.0;在20~55℃和pH6.0~9.0范围内有良好的稳定性;金属蛋白酶抑制剂乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA)、乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸(ethylenebis(oxyethylenenitrilo tetraacetic acid,EGTA)对ColM13有显著的抑制作用。采用紫外光谱(ultraviolet and visible spectrum,UV)、差示量热扫描(differential scanning calorimeter,DSC)、荧光光谱(FS)、傅里叶红外光谱(FT-IR)对骨胶原蛋白及其酶解产物进行结构特性分析,分析可知酶解作用使骨胶原蛋白的三股螺旋结构遭到破坏,释放出大量的游离氨基酸。酶解后胶原蛋白的肽链上-NH_2^+-相互排斥减弱,疏水氨基酸残基作用增强,具有更高的热稳定性。与*** MBL13-U分离纯化出的胶原酶(BSC)相比,ColM13处理的胶原蛋白的降解效果更明显。

关键词：工程菌pET30a-ColM13/BL21 重组胶原酶ColM13 胶原蛋白酶学结构特性