检索结果-南通市图书馆

牛纽布病毒Taq Man荧光定量RTGPCR检测方法的建立及应用

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中国兽医学报 2022年

作者：赵润涛王旭芬侯琳张贺赵洋张志丹周伟光内蒙古农业大学兽医学院农业农村部动物疾病临床诊疗技术重点实验室

牛纽布病毒(Bovine nebovirus,BNeV)是国内近几年发现的引起犊牛腹泻的新病原,为了建立快速、准确且能定量分析BNeV的检测方法,本试验根据GenBank上发布的BNeV聚合酶基因(RdRp)序列设计合成了1对特异性引物和1条探针,并通过优化反应体系...

牛纽布病毒(Bovine nebovirus,BNeV)是国内近几年发现的引起犊牛腹泻的新病原,为了建立快速、准确且能定量分析BNeV的检测方法,本试验根据GenBank上发布的BNeV聚合酶基因(RdRp)序列设计合成了1对特异性引物和1条探针,并通过优化反应体系,成功建立了BNeV TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法并对临床样品进行了检测。结果表示,该方法最佳上下游引物浓度均为500 nmol/L,探针浓度为400 nmol/L,在1×10~8～1×10~1拷贝/μL之间呈现良好的线性关系,线性相关系数R~2=0.996,扩增效率为105.9%;该方法特异性较强,在多个犊牛腹泻相关病原中,只检测出BNeV;敏感性较高,对BNeV质粒标准品最低检测下限为1×10~1拷贝/μL,而普通PCR对BNeV质粒标准品最低检测下限为1×10~3拷贝/μL;重复性较好,组内变异系数和组间变异系数均小于3%;对2021年3～5月采自内蒙古地区牧场的37份犊牛粪样中BNeV的检出率为35.1%,通过标准曲线计算其病毒载量,其中腹泻粪样平均病毒载量为8.7×10~5拷贝/μL。本研究建立的BNeV TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的特异性强、稳定性好、灵敏度高,为BNeV的检测和分子流行病学调查提供了有力的手段

关键词：

捻转血矛线虫丙硫咪唑耐药相关lncRNA的转录组学测序与分析

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生物工程学报 2020年第2期36卷 250-258页

作者：赵学亮王文龙呼和巴特尔内蒙古农业大学兽医学院农业农村部动物疾病临床诊疗技术重点实验室

分析捻转血矛线虫敏感株和耐药株中长链非编码RNA (Long non-coding RNA,lncRNA)的表达谱,探讨lncRNA与捻转血矛线虫丙硫咪唑耐药机制的关联性,为捻转血矛线虫耐药机理提供依据。文中对捻转血矛线虫敏感株和耐药株进行cDNA测序文库构建... 详细信息

分析捻转血矛线虫敏感株和耐药株中长链非编码RNA (Long non-coding RNA,lncRNA)的表达谱,探讨lncRNA与捻转血矛线虫丙硫咪唑耐药机制的关联性,为捻转血矛线虫耐药机理提供依据。文中对捻转血矛线虫敏感株和耐药株进行cDNA测序文库构建,使用Illumina HiSeq 4000平台进行双端测序,筛选出差异的lncRNA,基于顺式调控(cis)和反式调控(trans)对差异显著的lncRNA进行靶基因预测,并对靶基因进行过Gene Ontology (GO)功能注释和KEGG Pathway富集分析,利用FPKM法估计lncRNA和mRNA的表达水平。结果表明,敏感株和耐药株候选lncRNA分别为6 377和6 356个,两个文库中筛选出168个差异显著的lncRNA,其中在敏感株中表达上调有92个,表达下调76个。筛选得到的差异显著lncRNA候选靶基因416个,这些基因共注释到641条GO terms和92条信号通路;其中富集到耐药性相关的通路有药物代谢-其他酶、药物代谢-细胞色素P450、细胞色素P450对异生素的代谢等。综上表明,部分lncRNA介导的靶基因与捻转血矛线虫丙硫咪唑耐药性相关,lncRNA在捻转血矛线虫耐药性中具有潜在的重要的调节作用。探究了对于敏感虫株和耐药虫株中lncRNA的表达谱,发现了敏感虫株和耐药虫株中差异表达的lncRNA,有助于找出捻转血矛线虫如何抵抗丙硫咪唑的发生机制,为探讨捻转血矛线虫丙硫咪唑耐药机制提供科学的依据。

关键词：捻转血矛线虫丙硫咪唑耐药性转录组长链非编码RNA

EGFRvIII胞外区基因重组腺病毒的构建及单域抗体的制备

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生物工程学报 2022年

作者：张慧敏徐嘉奇程艺付山刘艳龙胡宇靖杜雅楠包福祥内蒙古农业大学兽医学院内蒙古农业大学农业农村部动物疾病临床诊疗技术重点实验室

本研究旨在构建能够表达人表皮生长因子EGFRvIII胞外区基因的重组腺病毒，并通过免疫骆驼构建噬菌体单域抗体库，筛选和制备EGFRvIII胞外区特异性单域抗体并对其进行鉴定。从人前列腺癌细胞系PC-3细胞中提取总RNA，反转录为cDNA，以cDN...

本研究旨在构建能够表达人表皮生长因子EGFRvIII胞外区基因的重组腺病毒，并通过免疫骆驼构建噬菌体单域抗体库，筛选和制备EGFRvIII胞外区特异性单域抗体并对其进行鉴定。从人前列腺癌细胞系PC-3细胞中提取总RNA，反转录为cDNA，以cDNA为模板扩增EGFRvIII胞外区基因，并连接pAdTrack-CMV质粒载体，转化含有pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183感受态细胞，获得同源重组质粒转染HEK293A细胞，得到表达EGFRvIII胞外区蛋白的重组腺病毒。利用重组腺病毒免疫双峰驼，构建EGFRvIII胞外区特异性噬菌体单域抗体库，并以EGFRvIII蛋白为筛选抗原，对其进行筛选，对筛选得到的单域抗体进行诱导表达、纯化及鉴定。结果表明获得了表达EGFRvIII胞外区基因的重组腺病毒。构建得到的EGFRvIII特异性噬菌体单域抗体库的库容为1.4×10;；经过3轮富集和筛选，通过phageELISA筛选出31个与EGFRvIII胞外区蛋白结合的阳性克隆，并对OD;值较高的重组单域抗体E14进行了表达和纯化。经ELISA 鉴定，重组单域抗体E14可与EGFRvIII胞外区蛋白产生抗原抗体结合反应，具有较高的亲和力。说明制备的EGFRvIII特异性噬菌体单域抗体库具有较高的库容和多样性，且筛选得到的单域抗体具有较高的抗原活性和免疫学反应性，为今后以EGFRvIII为靶点的恶性肿瘤的诊断和治疗提供新的实验依据。

关键词：

牛病毒性腹泻病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

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中国动物传染病学报 2023年

作者：王亚新陈萌萌王露李欣赵洪哲温永俊王凤雪内蒙古农业大学兽医学院农业农村部动物疾病临床诊疗技术重点实验室

为建立一种针对牛病毒性腹泻病毒的检测方法，本研究针对牛病毒性腹泻病毒的5’UTR设计特异性引物及TaqMan探针，进行扩增，进而构建阳性重组质粒。经过条件优化建立了牛病毒性腹泻病毒的TaqMan荧光定量PCR检测方法。结果显示，建立的... 详细信息

为建立一种针对牛病毒性腹泻病毒的检测方法，本研究针对牛病毒性腹泻病毒的5’UTR设计特异性引物及TaqMan探针，进行扩增，进而构建阳性重组质粒。经过条件优化建立了牛病毒性腹泻病毒的TaqMan荧光定量PCR检测方法。结果显示，建立的实时荧光定量PCR检测方法在阳性标准质粒拷贝数在1×104～1×108拷贝/μL时线性关系良好，线性相关系数R2=0.998。该方法最低检测限为10拷贝/μL；可以特异性检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)，与牛冠状病毒(BCV)、牛轮状病毒(BRV)、牛副流感病毒3型(BPIV-3)、以及牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)不发生交叉反应，病毒滴度与拷贝数线性关系良好，线性相关系数R2=0.997；与商品检测化试剂盒的符合率为97.5%。该方法为牛病毒性腹泻病毒的早期快速诊断提供了有力的技术支持。

关键词：牛病毒性腹泻病毒 TaqMan荧光定量PCR 5’UTR

鸽圆环病毒Cap基因SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR方法的建立及应用

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中国动物传染病学报 2022年

作者：韩晓语杨俊杰赵洪哲郭昊王亚新王凤雪内蒙古农业大学兽医学院农业农村部动物疾病临床诊疗技术重点实验室

为建立一种针对鸽圆环病毒（PiCV）的快速诊断方法，试验根据PiCV的Cap保守基因序列，设计合成一对特异性引物，建立了PiCV荧光定量PCR检测方法，对其敏感性、特异性、重复性进行评价并利用该方法对临床样本进行检测。结果表明：在最佳...

为建立一种针对鸽圆环病毒（PiCV）的快速诊断方法，试验根据PiCV的Cap保守基因序列，设计合成一对特异性引物，建立了PiCV荧光定量PCR检测方法，对其敏感性、特异性、重复性进行评价并利用该方法对临床样本进行检测。结果表明：在最佳反应条件下，所建立的PiCV荧光定量PCR方法在1×10;～1×10;copies/μL标准品范围内具有良好的线性相关性，线性相关系数为0.9846；敏感性试验结果显示，该方法最低可检测到1×10;copies/μL标准品，是常规PCR检测方法的100倍；特异性试验结果显示，该方法与其他常见的鸽病病原不发生交叉反应；重复性评价结果显示，批内与批间的变异系数均小于2%；所建立PiCV荧光定量PCR方法对临床病死鸽肝脏样品检测结果显示，PiCV阳性率达75.7%，高于常规PCR方法的检测阳性率（54.1%），说明该方法具有良好的适用性。可应用于对PiCV的快速检测，为PiCV的及时防控提供有力技术支持。

关键词：

牛纽布病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

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中国兽医学报 2023年第1期43卷 66-71页

作者：赵润涛王旭芬侯琳张贺赵洋张志丹周伟光内蒙古农业大学、兽医学院、农业农村部动物疾病临床诊疗技术重点实验室内蒙古呼和浩特010018

牛纽布病毒(bovine nebovirus,BNeV)是国内近几年发现的引起犊牛腹泻的新病原,为了建立快速、准确且能定量分析BNeV的检测方法,本试验根据GenBank上发布的BNeV聚合酶基因(RdRp)序列设计合成了1对特异性引物和1条探针,并通过优化反应体系... 详细信息

牛纽布病毒(bovine nebovirus,BNeV)是国内近几年发现的引起犊牛腹泻的新病原,为了建立快速、准确且能定量分析BNeV的检测方法,本试验根据GenBank上发布的BNeV聚合酶基因(RdRp)序列设计合成了1对特异性引物和1条探针,并通过优化反应体系,成功建立了BNeV TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法并对临床样品进行检测。结果表示,该方法最佳上下游引物浓度均为500 nmol/L,探针浓度为400 nmol/L,在1×10^(8)~1×10^(1)拷贝/μL之间呈现良好的线性关系,线性相关系数R^(2)=0.996,扩增效率为10^(5).9%;该方法特异性较强,在多个犊牛腹泻相关病原中,只检测出BNeV;敏感性较高,对BNeV质粒标准品最低检测下限为1×10^(1)拷贝/μL,而普通PCR对BNeV质粒标准品最低检测下限为1×10^(3)拷贝/μL;重复性较好,组内变异系数和组间变异系数均小于3%;对2021年3-5月采自内蒙古地区牧场的37份犊牛粪样中BNeV的检出率为35.1%,通过标准曲线计算其病毒载量,其中腹泻粪样平均病毒载量为8.7×10^(5)拷贝/μL。本研究建立的BNeV TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的特异性强、稳定性好、灵敏度高,为BNeV的检测和分子流行病学调查提供了有力的手段。

关键词：牛纽布病毒荧光定量RT-PCR 犊牛腹泻特异性敏感性重复性

表达牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的嵌合狂犬病病毒生物学特性

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中国兽医学报 2023年第12期43卷 2451-2456页

作者：李欣李伊铭赵洪哲王亚新王凤雪温永俊内蒙古农业大学兽医学院农业农村部动物疾病临床诊疗技术重点实验室内蒙古呼和浩特010018

牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)引起牛发热、腹泻、黏膜糜烂溃疡等症状,给养牛业带来严重经济损失,新型疫苗的研发意义重大。狂犬病病毒(rabies virus,RV)作为病毒载体可稳定表达外源蛋白,反过来外源蛋白也不会阻... 详细信息

牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)引起牛发热、腹泻、黏膜糜烂溃疡等症状,给养牛业带来严重经济损失,新型疫苗的研发意义重大。狂犬病病毒(rabies virus,RV)作为病毒载体可稳定表达外源蛋白,反过来外源蛋白也不会阻碍病毒的复制。本研究目的是利用反向遗传操作技术构建和拯救表达BVDV结构蛋白的重组RV,以期获得一种能表达高水平BVDV E2蛋白的重组病毒。选择Ⅰ型BVDV主要优势抗原E2蛋白基因序列进行优化后合成E2基因片段,利用Overlap PCR的方法将E2基因改造为DE2片段,以RV疫苗毒株LBNSE为病毒载体,利用BsiWⅠ和NheⅠ酶切位点,将DE2基因插入LBNSE基因组中,成功构建pRV-DE2重组质粒。脂质体法将全长重组质粒转染BSR细胞后,拯救重组病毒RV-DE2,并用直接免疫荧光和RT-PCR的方法对其鉴定,对构建成功的病毒进行生长特性、致病性、重组蛋白表达特性等生物学特性和小鼠体内免疫效力的研究。结果表明,RV-DE2病毒滴度在F3代之后趋于稳定,在相同的培养条件下比亲本LBNSE病毒滴度高。重组病毒对小鼠无致死性,E2蛋白表达量高于BVDV。将灭活的重组病毒免疫小鼠后成功产生了抗BVDV的中和抗体。表达BVDV E2的重组RV的成功拯救为BVDV新型疫苗的研发提供候选毒株,对BVD的防控提供了一种新的思路。

关键词： BVDV E2蛋白 RV疫苗毒株 LBNSE 反向遗传操作直接免疫荧光

基于CA-TM融合蛋白的梅迪-维斯纳病毒胶体金免疫层析检测方法的建立与应用

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中国兽医科学 2024年

作者：陈思旭包磊李慧萍张良刘淑英农业农村部动物疾病临床诊疗技术重点实验室内蒙古自治区基础兽医学重点实验室内蒙古农业大学兽医学院

旨在建立一种快速、准确的梅迪-维斯纳病毒（MVV）抗体的胶体金免疫层析检测方法。利用本实验室的重组CA-TM融合蛋白（rCA-TM）标记检测线，以鸡IgY抗体标记质控线，以重组链球菌蛋白（r-SPG）与鸡IgY用于胶体金标记。经各条件优化建立... 详细信息

旨在建立一种快速、准确的梅迪-维斯纳病毒（MVV）抗体的胶体金免疫层析检测方法。利用本实验室的重组CA-TM融合蛋白（rCA-TM）标记检测线，以鸡IgY抗体标记质控线，以重组链球菌蛋白（r-SPG）与鸡IgY用于胶体金标记。经各条件优化建立MVV胶体金免疫层析快速检测方法，并通过特异性、敏感性、稳定性以及临床应用对其检测效果进行评价。结果显示，成功表达、纯化并获得了rCA-TM；成功建立的胶体金免疫层析法特异性试验结果显示不能检测除MVV以外的如口蹄疫病毒、小反刍兽疫病毒、绵羊肺炎支原体、布鲁菌等绵羊常见病原；敏感性试验结果显示最低可检出2400倍稀释的MVV阳性血清；稳定性试验结果显示在模拟6个月避光常温密封保存后的试纸条仍具有良好的检测性能。利用建立的MVV胶体金检测法和广泛应用于MVV检测的进口商品化MVV抗体ELISA检测试剂盒对40份疑似病例血清样品进行对比检测，结果显示：用胶体金检测方法检出MVV抗体阳性血清17份，阴性血清23份；用进口商品化MVV抗体ELISA检测试剂盒检出阳性血清16份，阴性血清24份，二者相比整体符合率为97.5%。综上，成功建立了MVV胶体金免疫层析快速检测方法，该方法研制的检测试纸条性能良好、便于储存、适合现场快速检测和批量检测，对MVV的监测、防控有重要意义，为内蒙古地区MVV的净化提供新的检测方案。

关键词：梅迪-维斯纳病毒原核表达融合蛋白胶体金免疫层析

Nesfatin-1对饥饿小鼠氧化应激及自噬的影响

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黑龙江畜牧兽医 2024年第3期 10-15页

作者：王铭玉斯日古楞陈宇飞谢志凤罗雨晨么宏强内蒙古农业大学兽医学院农业农村部动物疾病临床诊疗技术重点实验室呼和浩特010018

为了研究在急性禁食状态下Nesfatin-1对机体氧化应激及自噬的影响,试验构建小鼠饥饿模型,将50只小鼠随机均分为阴性对照组、禁食24 h组、禁食48 h组、Nesfatin-1+禁食24 h组、Nesfatin-1+禁食48 h组。禁食24,48 h组小鼠分别禁食24 h及48... 详细信息

为了研究在急性禁食状态下Nesfatin-1对机体氧化应激及自噬的影响,试验构建小鼠饥饿模型,将50只小鼠随机均分为阴性对照组、禁食24 h组、禁食48 h组、Nesfatin-1+禁食24 h组、Nesfatin-1+禁食48 h组。禁食24,48 h组小鼠分别禁食24 h及48 h;Nesfatin-1+禁食24 h组及Nesfatin-1+禁食48 h组分别在禁食24,48 h基础上按每20 g体重腹腔注射1.25 nmol/g Nesfatin-1 0.26 mL;阴性对照组腹腔注射同等剂量PBS。对各组小鼠进行眼球采血,处死后解剖取脑、肝脏组织。采用化学荧光法测定各组小鼠肝脏氧化基因指标活性氧(reactive oxygen species,ROS)荧光强度,采用ELISA方法测定各组小鼠血清丙二醛(malonaldehyde,MDA)和Nesfatin-1含量,运用实时荧光定量PCR方法测定各组自噬相关基因Beclin-1、LC3、P62 mRNA相对表达量。结果表明:与阴性对照组相比,禁食24 h组及禁食48 h组小鼠ROS荧光强度、MDA含量极显著升高(P<0.01),脑组织Beclin-1、LC3 mRNA相对表达量显著或极显著上调(P<0.05或P<0.01),P62 mRNA相对表达量极显著降低(P<0.01);在禁食24,48 h后,小鼠血清Nesfatin-1含量显著降低(P<0.05),使用Nesfatin-1干预后,其含量极显著升高(P<0.01);与禁食24 h组相比,Nesfatin-1+禁食24 h组小鼠的ROS、MDA含量和Beclin-1、LC3 mRNA相对表达量极显著降低(P<0.01),P62 mRNA相对表达量显著升高(P<0.05);与禁食48 h组相比,Nesfatin-1+禁食48 h组小鼠的ROS、MDA含量和Beclin-1、LC3 mRNA相对表达量极显著降低(P<0.01),P62 mRNA相对表达量极显著升高(P<0.01)。说明急性禁食会使小鼠体内Nesfatin-1含量降低,氧化应激与自噬水平上调,Nesfatin-1能增强细胞活力,注射Nesfatin-1后可以降低小鼠体内的氧化应激水平,也能够降低小鼠在急性禁食状态下上调的自噬水平。

关键词： Nesfatin-1 饥饿氧化应激活性氧自噬