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K亚群禽白血病病毒CRISPR/Cas13a检测方法的建立及初步应用

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中国动物传染病学报 2023年第3期31卷 113-119页

作者：徐晴晴王峰王文秀莫玲沈志强山东省滨州畜牧兽医研究院博士后科研工作站滨州256600 扬州大学博士后科研流动站扬州225009 太仓广东温氏家禽有限公司太仓215488 山东省院士工作站滨州256600

为了快速、准确和简便地检测K亚群禽白血病病毒(ALV-k),本研究参照GenBank中ALV-k的gp85基因设计了特异的RPA引物和用于LwCas13a反应系统的crRNA,通过优化反应条件建立了检测ALV-k的CRISPR/Cas13a方法,并验证了该方法的特异性、敏感性... 详细信息

为了快速、准确和简便地检测K亚群禽白血病病毒(ALV-k),本研究参照GenBank中ALV-k的gp85基因设计了特异的RPA引物和用于LwCas13a反应系统的crRNA,通过优化反应条件建立了检测ALV-k的CRISPR/Cas13a方法,并验证了该方法的特异性、敏感性和符合性。结果显示,该法对感染鸡的其他常见病毒的检测均为阴性,特异性良好无交叉反应;灵敏度为50 copies/μL;与PCR的检测结果有很好的符合性。本研究建立的CRISPR/Cas13a检测方法配合试纸条显色在1.5 h左右可对ALV-k进行快速的鉴别诊断,为该病的诊断及防控净化提供了强有力的技术支撑。

关键词： K亚群禽白血病病毒 RPA crRNA CRISPR/Cas13a

K亚群禽白血病病毒的分离鉴定及其gp85蛋白单克隆抗体的研制

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K亚群禽白血病病毒的分离鉴定及其gp85蛋白单克隆抗体的研制

作者：杭富森扬州大学

学位级别：硕士

禽白血病(Avian Leukemia)是由禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus,ALV)引起的禽类肿瘤性疾病,是常见家禽免疫抑制病的一种。感染鸡群的禽白血病病毒包括A、B、C、D、E、J、k七个亚群,其中近几年鉴定的ALV-k主要存在于东亚地区,近年来... 详细信息

禽白血病(Avian Leukemia)是由禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus,ALV)引起的禽类肿瘤性疾病,是常见家禽免疫抑制病的一种。感染鸡群的禽白血病病毒包括A、B、C、D、E、J、k七个亚群,其中近几年鉴定的ALV-k主要存在于东亚地区,近年来在我国鸡群中常有报道。ALV全基因组约为7.3 kb,由gag、pol、env基因编码结构蛋白,其中env基因中的gp85基因编码的病毒囊膜表面蛋白具有病毒受体决定簇,决定亚群特性,可用于检测不同亚群病毒,在ALV感染中具有重要意义。本论文从ALV-k毒株的分离及全基因分析、ALV-k gp85蛋白的表达及其单克隆抗体制备、抗原表位的鉴定等三个方面进行研究。本研究结果对ALV-k的监测、ALV-k gp85蛋白抗原的了解及ALV-k检测方法的建立具有一定意义。1.K亚群禽白血病病毒的分离鉴定及全基因组分析利用病毒分离、ELISA和IFA检测方法从不同地区送检鸡群样本中分离到3株复制速率较慢的外源性ALV毒株,经过ALV亚群多重PCR方法鉴定及gp85基因序列遗传进化图谱分析,证明3株ALV毒株为k亚群毒株,分别命名为JS2110-1、hn2112-11和AHXC2202-2,其全基因序列全长分别为7493 bp、7486 bp和7499 bp。全基因遗传进化树谱分析显示,分离株JS2110-1与DT190903、JS133LY19毒株属同一分支,同源性分别高达99.2%、99%;分离株hn2112-11与GD1701毒株属同一分支,同源性高达99.4%;分离株AHXC2202-2与DT190904毒株属同一分支,同源性高达99.1%,表现出一定地缘性关系。3株分离株的LTR基因长度在277 bp-285 bp,分离株间同源性在93.8-98.9%;gag基因长度均为2106 bp,高度保守,与选取的各亚群参考株gag基因序列比对,核苷酸同源性在95.1%-99.7%;pol基因长度均为2688 bp,在各亚群中保守性极高,同源性在96.8%-99.7%;JS2110-1和AHXC2202-2的gp85基因长度为1002 bp,而hn2112-11的gp85基因长度为1005 bp,3个分离株gp85基因与k亚群毒株同源性高达93.9%-99.9%;gp37基因均为609 bp,除J亚群外,分离株与其他亚群间gp37基因高度保守,同源性高达94.4%-99.7%。3株ALV-k的成功分离为下一阶段ALV-k gp85基因的表达及其单克隆抗体的制备提供了生物材料。2.ALV-k gp85基因的真核表达及其单克隆抗体的制备为了研制针对ALV-k gp85蛋白的单克隆抗体,本研究以分离到的ALV-k毒株AHXC2202-2基因组为模板,经PCR方法扩增其gp85基因后,采用同源重组一步克隆的方法将gp85基因克隆至本实验室保存的pCAGGS-RIgG载体上,构建带有兔IgG Fc的重组质粒pCAGGS-ALV-k gp85-RIgG。将重组质粒转染HEk-293T细胞后瞬时表达融合蛋白,以HRP羊抗兔IgG全分子抗体及鼠抗ALV-k gp85多抗进行Western-blot分析,可见大小约120 kDa的特异性条带,抗原性良好。融合蛋白经Protein G纯化柱纯化后进行SDS-PAGE分析,在120 kDa左右有较为纯净的条带。以纯化后的融合蛋白免疫小鼠,并进行细胞融合,以感染ALV-k的DF-1细胞筛选阳性杂交瘤细胞,结果成功获得4株稳定分泌针对ALV-k gp85蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为 mAb ALV-k-gp85-3H6、mAb ALV-k-gp85-1E1、mAb ALV-k-gp85-1B11、mAb ALV-k-gp85-5A4,Western-blot显示四株单抗反应性好且特异,只与ALV-k反应。本研究为ALV-k检测方法的建立、gp85蛋白新抗原表位的探明及gp85蛋白结构功能的研究提供了基础。3.K亚群禽白血病病毒gp85蛋白抗原表位的鉴定为了探明ALV-k gp85蛋白新的抗原表位,本研究利用肽扫描技术,以大肠杆菌原核表达系统,对gp85基因进行多片段截短表达。通过Western-blot方法检测截短蛋白与4株单克隆抗体的反应性,进行抗原表位的定位。结果证明,单抗识别的抗原表位是两个新的抗原表位200FCGRVP205、195RGPRYFCGRVP205,该表位在部分ALV-k毒株中高度保守,在部分毒株中存在个别氨基酸位点的差异。为ALV-k gp85蛋白抗原性分析提供了支撑,也为ALV-k检测方法的建立提供了参考。

关键词： K亚群禽白血病病毒全基因分析 gp85蛋白单克隆抗体抗原表位

禽白血病病毒k亚群HB2018003株感染性克隆构建

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畜牧与兽医 2022年第2期54卷 107-111页

作者：陈雪阳王后坤朱丽霖方春梁雄燕杨玉莹长江大学动物科学学院湖北荆州434025

为了获得背景明确清晰的禽白血病病毒k亚群(ALV-k)毒株,对地方性ALV-k毒株HB2018003采用酶切和同源重组两种方法进行感染性克隆构建及病毒拯救。使用PCR方法获得目的基因,经酶切、连接和同源重组后成功构建重组质粒Topo-003-ABC和Topo-0... 详细信息

为了获得背景明确清晰的禽白血病病毒k亚群(ALV-k)毒株,对地方性ALV-k毒株HB2018003采用酶切和同源重组两种方法进行感染性克隆构建及病毒拯救。使用PCR方法获得目的基因,经酶切、连接和同源重组后成功构建重组质粒Topo-003-ABC和Topo-003-k12,测序结果表明无任何突变,进而将重组质粒转染进鸡胚成纤维细胞(DF-1)中,经群特异性抗原P27 ELISA、PCR和间接免疫荧光(IFA)鉴定,结果均表明成功拯救出病毒,将其命名为R-rHB2018003(同源重组法)和E-rHB2018003(酶切法)。本研究为深入探讨ALV-k的致病机制奠定了基础。

关键词： K亚群禽白血病病毒感染性克隆病毒拯救

K亚群禽白血病病毒分离株全基因组测序及序列分析

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中国兽医学报 2019年第6期39卷 1091-1098页

作者：俞燕周生徐步邵红霞钱琨叶建强秦爱建扬州大学兽医学院教育部禽类预防医学重点实验室/江苏省动物预防医学重点实验室江苏扬州225009 江苏省家禽科学研究所江苏扬州225125

K亚群禽白血病病毒(ALV-k)是近年来从地方品种鸡分离鉴定的新亚群ALV。本试验在对江苏某原种鸡场保存的琅琊鸡开展禽白血病净化过程中,分离并鉴定1株ALV-k,命名为JS13LY19。为探明其基因组来源及特征,对JS13LY19分离株前病毒DNA进行了... 详细信息

K亚群禽白血病病毒(ALV-k)是近年来从地方品种鸡分离鉴定的新亚群ALV。本试验在对江苏某原种鸡场保存的琅琊鸡开展禽白血病净化过程中,分离并鉴定1株ALV-k,命名为JS13LY19。为探明其基因组来源及特征,对JS13LY19分离株前病毒DNA进行了分段克隆和测序,获得全长基因组序列,并与各亚群ALV参考株进行比对分析。结果显示,JS13LY19分离株符合复制完整型C型反转录病毒特征,缺乏肿瘤基因。其gp85基因相较于其他亚群ALV,与ALV-k参考株遗传进化关系最为接近,与ALV-k原型株JS11C1一致性最高(99.2%);而gag、pol、gp37、LTR、UTR及JS13LY19与内源性ALV显示出更高的一致性(92.0%~99.4%);其LTR U3区比大部分外源性ALV LTR少了1个CAAT enhancer盒、PRE盒、CArG盒及Y盒。JS13LY19分离株极有可能是JS11C1与内源性ALV重组产生,且具有内源性ALV LTR及U3区转录调控元件的部分缺失,可能使JS13LY19转录能力下降而致病性降低。

关键词： K亚群禽白血病病毒序列分析 LTR 转录调控元件地方品种鸡

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K亚群禽白血病病毒细胞受体的鉴定

中国预防兽医学报 2020年第8期42卷 802-808页

作者：邢立晓俞燕于蒙蒙常方方包媛玲王素艳高立祁小乐王笑梅高玉龙中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽免疫抑制病研究创新团队黑龙江哈尔滨150069 江苏省家禽科学研究所江苏扬州225125

禽白血病病毒(ALV)进入细胞启动感染依赖于其囊膜表面蛋白gp85与细胞受体的结合。k亚群ALV(ALV-k)是2012年从我国本地芦花鸡中分离到的一个ALV新亚群。为了鉴定ALV-k的细胞受体,本研究利用真核细胞表达了A和k亚群ALV gp85蛋白,并利用实... 详细信息

禽白血病病毒(ALV)进入细胞启动感染依赖于其囊膜表面蛋白gp85与细胞受体的结合。k亚群ALV(ALV-k)是2012年从我国本地芦花鸡中分离到的一个ALV新亚群。为了鉴定ALV-k的细胞受体,本研究利用真核细胞表达了A和k亚群ALV gp85蛋白,并利用实验室前期拯救的重组病毒RCAS-A-GFP和RCAS-k-GFP进行病毒受体的交叉干扰试验,结果显示A亚群ALV(ALV-A)gp85蛋白能够抑制ALV-k的感染,同样ALV-kgp85蛋白也能够抑制ALV-A的感染,存在受体交叉干扰现象,因而推测二者可能共用细胞受体。已有研究表明Tva是ALV-A的细胞受体,本研究利用Co-IP和Pull-down试验检测了ALV-kgp85与Tva的互作,结果显示ALV-kgp85蛋白能与可溶性的Tva(sTva)相互作用。进一步的流式细胞术结果显示ALV-kgp85能够高效结合Tva,结合率在90%以上。为进一步验证Tva是否能介导ALV-k进入细胞,利用ALV的非易感细胞HEk293T进行了Tva受体重建试验,结果显示RCAS-k-GFP能够进入表达Tva的293T细胞并复制产生较强的绿色荧光。以上结果充分表明Tva也是ALV-k的细胞受体,能够介导ALV-k进入宿主细胞,启动其感染。该研究为阐明ALV-k侵入宿主细胞机制及抗病毒靶点筛选奠定了基础。

关键词： K亚群禽白血病病毒细胞受体 Tva蛋白结合进入

K亚群禽白血病病毒抗体间接ELISA检测方法的建立

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中国兽医科学 2017年第11期47卷 1349-1356页

作者：袁丽霞饶明章张杰赵子君陈建陈杨一骏严立福郑晓翠谢暮晴曹伟胜华南农业大学兽医学院农业部兽用疫苗创制重点实验室广东广州510642

为了研究K亚群禽白血病病毒抗体间接ELISA检测方法,以ALV-k GDFX0603株为模板,扩增其gp85基因,构建原核表达质粒p ET-GDFX0603-gp85,筛选原核表达菌液的诱导条件,采用Ni柱纯化表达的重组蛋白;以纯化后重组蛋白作为包被抗原,研究ALV-k抗... 详细信息

为了研究K亚群禽白血病病毒抗体间接ELISA检测方法,以ALV-k GDFX0603株为模板,扩增其gp85基因,构建原核表达质粒p ET-GDFX0603-gp85,筛选原核表达菌液的诱导条件,采用Ni柱纯化表达的重组蛋白;以纯化后重组蛋白作为包被抗原,研究ALV-k抗体间接ELISA检测方法。结果显示,表达的gp85重组蛋白以包涵体形式存在,大小为53 ku。Western-blot分析表明,该蛋白具有良好的免疫反应性;重复性试验结果显示,板内重复性的CV最大值为10.41%;板间重复性的CV最大值为12.57%,CV值均小于15%。特异性试验结果显示,该方法除了对ALV-A阳性血清有弱的交叉反应外,对ALV-B、ALV-J、AIV、NDV、IBDV、MDV、REV、大肠杆菌和沙门菌的阳性血清均无交叉反应。结果表明,初步建立了检测ALV-k抗体的间接ELISA方法,该方法具有良好的板内和板间重复性及较强的特异性。

关键词： K亚群禽白血病病毒 gp85蛋白原核表达间接ELISA

K亚群禽白血病病毒gp85单因子血清的制备及其特异性鉴定

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中国畜牧兽医 2016年第2期43卷 371-376页

作者：孙鹏陈孜孟赵国梁崔宁祖铭崔治中苏帅山东农业大学动物医学院泰安271018 山东省畜牧业贸易服务中心济南250000

为了制备一种快速特异性识别K亚群禽白血病病毒(ALV-k)的单因子血清,本试验将ALV-k接种DF1细胞,提取感染细胞DNA作为模板,PCR扩增1 005bp ALV-k-gp85和510bp ALV-k-gp85(fragment)基因。将其正确的阅读框插入表达载体pET-28a(+)中,转化... 详细信息

为了制备一种快速特异性识别K亚群禽白血病病毒(ALV-k)的单因子血清,本试验将ALV-k接种DF1细胞,提取感染细胞DNA作为模板,PCR扩增1 005bp ALV-k-gp85和510bp ALV-k-gp85(fragment)基因。将其正确的阅读框插入表达载体pET-28a(+)中,转化大肠杆菌BL21(Rosetta)菌株中表达。将表达蛋白常规免疫昆明白小鼠制备抗血清。结果表明成功获得39.85和22.01ku的重组融合蛋白,且具有良好的免疫原性。间接免疫荧光试验(IFA)结果表明两血清均可与ALV-k反应,而不与ALV-A、ALV-B和ALV-J反应。本试验首次研制获得能特异性识别ALV-k的单因子血清,为k亚群禽白血病的快速检测奠定了基础。

关键词： K亚群禽白血病病毒 gp85基因表达间接免疫荧光试验(IFA) 单因子血清

K亚群禽白血病病毒分离株基因测序与鉴定分析

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黑龙江畜牧兽医 2021年第23期 88-93,155页

作者：沈晓鹏曹斌王传峰陈则东马跃朱建平王成丽叶建强俞燕李拓凡张俊江苏农牧科技职业学院江苏泰州225300 扬州大学兽医学院江苏扬州225009

为了对从江苏省某种鸡场保种的崇仁麻鸡血浆中分离的禽白血病病毒(ALV)进行序列测定和亚群鉴定,试验采用ELISA法检测血浆样品p27抗原,并用从阳性血浆中分离的病毒接种DF1细胞进行免疫荧光检测,提取前病毒DNA,用ALV亚群鉴定引物进行PCR鉴... 详细信息

为了对从江苏省某种鸡场保种的崇仁麻鸡血浆中分离的禽白血病病毒(ALV)进行序列测定和亚群鉴定,试验采用ELISA法检测血浆样品p27抗原,并用从阳性血浆中分离的病毒接种DF1细胞进行免疫荧光检测,提取前病毒DNA,用ALV亚群鉴定引物进行PCR鉴定,前病毒DNA分3段扩增并测序,对测序结果进行拼接,用MEGA 7.0软件以NJ法对分离株病毒gp85基因编码的氨基酸序列和参考株进行遗传进化分析,采用DNAStar 7.0软件以Clustal W法对参考株与分离株病毒的gp37基因进行比对分析。结果表明:有1份样品的p27抗原ELISA反应呈阳性,免疫荧光检测也呈阳性,将该分离株命名为JS20CR13。k亚群引物PCR检测出大小为560 bp的目的片段。前病毒全基因组总长7 481 bp,其中env基因大小为1 617 bp(gp85基因1 008 bp,编码336个氨基酸;gp37基因大小为609 bp,编码203个氨基酸)。与各参考株对比,分离株JS20CR13的gp85基因序列与k亚群参考株同源性为94.0%~99.0%,明显高于其他亚群;gp85基因编码氨基酸序列与已经鉴定为ALV-k的参考株病毒位于同一个进化分支,而与其他亚群的遗传进化距离较远。分离株JS20CR13的gp37基因序列与ALV-k参考株JS14CZ01同源性最高,达99.0%。说明分离株JS20CR13与已经鉴定为ALV-k的参考株病毒位于同一个进化分支,分离株为k亚群ALV。

关键词： K亚群禽白血病病毒崇仁麻鸡遗传进化树 gp85基因 gp37基因

K亚群禽白血病病毒gp85基因的克隆表达及多克隆抗体的制备

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中国家禽 2019年第19期41卷 55-58页

作者：吕璐胡明月邓菁菁刘勇李拓凡谢菁谢泉邵红霞秦爱建叶建强扬州大学兽医学院禽类预防医学教育部重点实验室江苏省动物预防医学重点实验室江苏扬州225009 江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心江苏扬州225009 扬州大学农业科技发展研究院江苏扬州225009 教育部农业与农产品安全国际合作联合实验室江苏扬州225009

研究分别将K亚群禽白血病病毒(ALV-k)的gp85基因以及env基因分别克隆到原核表达载体pColdⅠ以及真核表达载体pcDNA3.1(+),测序验证后分别命名为pCold-k-gp85以及pcDNA3.1-k-env。pCold-k-gp85转化BL21大肠杆菌,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析发现,该Gp85重组蛋白主要表达在包涵体中。利用纯化后Gp85重组蛋白免疫BALB/c小鼠,制备了抗ALV-kGp85蛋白的多克隆抗体。间接免疫荧光以及Westernblot试验进一步证明,所获得的抗Gp85蛋白的多克隆抗体能特异性的识别转染pcDNA3.1-k-env质粒以及感染ALV-k的DF-1细胞内表达的Env蛋白。以上研究结果为进一步探究ALV-k宿主范围,细胞受体鉴定及亚群特异性诊断技术研究奠定了基础。

关键词： K亚群禽白血病病毒 gp85基因多克隆抗体