K亚群禽白血病病毒的分离鉴定及其gp85蛋白单克隆抗体的研制

作     者：杭富森 

作者单位：扬州大学 

学位级别：硕士

导师姓名：秦爱建

授予年度：2023年

学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：K亚群禽白血病病毒 全基因分析 gp85蛋白 单克隆抗体 抗原表位 

摘      要：禽白血病(Avian Leukemia)是由禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus,ALV)引起的禽类肿瘤性疾病,是常见家禽免疫抑制病的一种。感染鸡群的禽白血病病毒包括A、B、C、D、E、J、K七个亚群,其中近几年鉴定的ALV-K主要存在于东亚地区,近年来在我国鸡群中常有报道。ALV全基因组约为7.3 Kb,由gag、pol、env基因编码结构蛋白,其中env基因中的gp85基因编码的病毒囊膜表面蛋白具有病毒受体决定簇,决定亚群特性,可用于检测不同亚群病毒,在ALV感染中具有重要意义。本论文从ALV-K毒株的分离及全基因分析、ALV-K gp85蛋白的表达及其单克隆抗体制备、抗原表位的鉴定等三个方面进行研究。本研究结果对ALV-K的监测、ALV-K gp85蛋白抗原的了解及ALV-K检测方法的建立具有一定意义。1.K亚群禽白血病病毒的分离鉴定及全基因组分析利用病毒分离、ELISA和IFA检测方法从不同地区送检鸡群样本中分离到3株复制速率较慢的外源性ALV毒株,经过ALV亚群多重PCR方法鉴定及gp85基因序列遗传进化图谱分析,证明3株ALV毒株为K亚群毒株,分别命名为JS2110-1、hn2112-11和AHXC2202-2,其全基因序列全长分别为7493 bp、7486 bp和7499 bp。全基因遗传进化树谱分析显示,分离株JS2110-1与DT190903、JS133LY19毒株属同一分支,同源性分别高达99.2%、99%;分离株hn2112-11与GD1701毒株属同一分支,同源性高达99.4%;分离株AHXC2202-2与DT190904毒株属同一分支,同源性高达99.1%,表现出一定地缘性关系。3株分离株的LTR基因长度在277 bp-285 bp,分离株间同源性在93.8-98.9%;gag基因长度均为2106 bp,高度保守,与选取的各亚群参考株gag基因序列比对,核苷酸同源性在95.1%-99.7%;pol基因长度均为2688 bp,在各亚群中保守性极高,同源性在96.8%-99.7%;JS2110-1和AHXC2202-2的gp85基因长度为1002 bp,而hn2112-11的gp85基因长度为1005 bp,3个分离株gp85基因与K亚群毒株同源性高达93.9%-99.9%;gp37基因均为609 bp,除J亚群外,分离株与其他亚群间gp37基因高度保守,同源性高达94.4%-99.7%。3株ALV-K的成功分离为下一阶段ALV-K gp85基因的表达及其单克隆抗体的制备提供了生物材料。***-K gp85基因的真核表达及其单克隆抗体的制备为了研制针对ALV-K gp85蛋白的单克隆抗体,本研究以分离到的ALV-K毒株AHXC2202-2基因组为模板,经PCR方法扩增其gp85基因后,采用同源重组一步克隆的方法将gp85基因克隆至本实验室保存的pCAGGS-RIgG载体上,构建带有兔IgG Fc的重组质粒pCAGGS-ALV-K gp85-RIgG。将重组质粒转染HEK-293T细胞后瞬时表达融合蛋白,以HRP羊抗兔IgG全分子抗体及鼠抗ALV-K gp85多抗进行Western-blot分析,可见大小约120 kDa的特异性条带,抗原性良好。融合蛋白经Protein G纯化柱纯化后进行SDS-PAGE分析,在120 kDa左右有较为纯净的条带。以纯化后的融合蛋白免疫小鼠,并进行细胞融合,以感染ALV-K的DF-1细胞筛选阳性杂交瘤细胞,结果成功获得4株稳定分泌针对ALV-K gp85蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为 mAb ALV-K-gp85-3H6、mAb ALV-K-gp85-1E1、mAb ALV-K-gp85-1B11、mAb ALV-K-gp85-5A4,Western-blot显示四株单抗反应性好且特异,只与ALV-K反应。本研究为ALV-K检测方法的建立、gp85蛋白新抗原表位的探明及gp85蛋白结构功能的研究提供了基础。3.K亚群禽白血病病毒gp85蛋白抗原表位的鉴定为了探明ALV-K gp85蛋白新的抗原表位,本研究利用肽扫描技术,以大肠杆菌原核表达系统,对gp85基因进行多片段截短表达。通过Western-blot方法检测截短蛋白与4株单克隆抗体的反应性,进行抗原表位的定位。结果证明,单抗识别的抗原表位是两个新的抗原表位200FCGRVP205、195RGPRYFCGRVP205,该表位在部分ALV-K毒株中高度保守,在部分毒株中存在个别氨基酸位点的差异。为ALV-K gp85蛋白抗原性分析提供了支撑,也为ALV-K检测方法的建立提供了参考。