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中华绒螯蟹Ficolin蛋白抗菌免疫的机制研究

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中华绒螯蟹Ficolin蛋白抗菌免疫的机制研究

作者：赵钶华东师范大学

学位级别：硕士

Ficolin是纤维蛋白原相关蛋白家族(FREPs)成员,在脊椎动物和无脊椎动物中作为一种新型凝集素发挥模式识别受体(PRR)的作用。在脊椎动物中,Ficolins是由三个多肽链构成的寡聚蛋白,通过其胶原蛋白样结构域组装成同源三聚体而构成亚基。其... 详细信息

Ficolin是纤维蛋白原相关蛋白家族(FREPs)成员,在脊椎动物和无脊椎动物中作为一种新型凝集素发挥模式识别受体(PRR)的作用。在脊椎动物中,Ficolins是由三个多肽链构成的寡聚蛋白,通过其胶原蛋白样结构域组装成同源三聚体而构成亚基。其中一些Ficolin是血清凝集素,可以与甘露聚糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶(MASPs)和小甘露聚糖凝集素(MBL)相关蛋白(s MAP)形成复合物,该复合物通过凝集素途径激活补体。在无脊椎动物中,Ficolin具有一个C端保守的纤维蛋白原相关结构域(FRe D),但其N端结构大不相同甚至未知,已知部分Ficolin具有一段卷曲螺旋结构(coiled coil),可能够促使多肽链形成类似哺乳动物Ficolin三聚体寡聚蛋白的作用。无脊椎动物Ficolin在功能上从两种途径发挥作用,一是发挥类似模式识别受体的凝集素作用,它能够识别入侵病原体PAMPs以促进对入侵病原体的清除,从而保护宿主免受感染;二是原始的调理吞噬作用,其作为一种调理素促进血细胞对病原微生物的吞噬作用以达到清除细菌的目的。本论文以中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)为研究对象,探究了Ficolin在调控中华绒螯蟹先天免疫的作用机制。基于中华绒螯蟹全基因组数据库和甲壳动物Ficolin基因序列,搜索和比对出了一种Ficolin同源物,并将其命名为EsFicolin。通过生物信息学分析,发现其具有一个信号肽,一个高度保守的C端纤维蛋白原相关结构域(FRe D)和用于三聚体形成的卷曲螺旋结构。多序列比对的结果证实C端FRe D结构域与其他甲壳动物FRe D结构域相似度极高,表明其在进化上高度保守,是重要的功能域结构。系统发育树的结果表明,EsFicolin与哺乳动物Ficolin聚为一支,而不与甲壳动物聚为一支,暗示EsFicolin在功能上与哺乳动物Ficolin的相似之处。RT-q PCR分析组织分布的结果表明,EsFicolin在肌肉、肝胰腺、肠道、胃和血细胞中均有表达,表明EsFicolin参与较为广泛的生理功能。受金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和副溶血弧菌(Vibrio Parahaemolyticus)刺激后,与对照组相比,EsFicolin在血细胞中显著上调,表明其与抗菌免疫反应的潜在关联。利用大肠杆菌原核表达系统表达和纯化了重组蛋白r EsFicolin,随后的化学交联实验证实重组的r EsFicolin蛋白在双(3-磺基-N-羟基琥珀酰亚胺酯)辛二酸酯钠盐(BS)存在的情况下,可以形成三聚体寡聚结构,Westren blot结果显示三聚体蛋白对应的条带与单体蛋白对应的条带相比,明显更粗颜色更深,表明三聚体寡聚蛋白数量大于单体蛋白数量,大部分蛋白质均以三聚体的结构存在。为了探究r EsFicolin能否发挥凝集素的作用,我们的凝集试验表明,r EsFicolin对金黄色葡萄球菌和副溶血弧菌均有很强的凝集活性,且对于革兰氏阴性菌的凝集活性更强。结合实验显示,r EsFicolin对五种革兰氏阴性菌和三种革兰氏阳性菌均具有结合能力,且对革兰氏阴性菌的结合能力更强。后续的多糖结合实验显示r EsFicolin以剂量依赖性的方式与细胞表明病原相关分子模式(PAMPs)结合,揭示了其识别并结合细菌的具体机制。深入研究发现,重组r EsFicolin蛋白可有效去除细菌,并表现出直接抗菌活性。r EsFicolin还可以促进血细胞的吞噬作用以增强细菌清除率。综上所述,EsFicolin作为中华绒螯蟹先天免疫系统中的一种模式识别受体,能够识别细胞表明病原相关分子模式(PAMPs)并凝集和结合细菌。其对抗入侵微生物的途径主要有两种:一方面,EsFicolin具有直接抑制细菌生长的活性,另一方面,发挥调理素的作用,促进中华绒螯蟹血细胞对细菌的吞噬作用,以达到清除细菌,保护宿主免受病原体感染的目的。这些发现表明EsFicolin在中华绒螯蟹的抗菌免疫反应中起着重要作用,本论文丰富了我们对于无脊椎动物Ficolin的功能研究,增强了我们对于无脊椎动物先天免疫系统的认知。

关键词： Ficolin 纤维蛋白原相关蛋白中华绒螯蟹模式识别受体抗菌免疫

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斑马鱼MMR1L基因的抗菌免疫机制研究

斑马鱼MMR1L基因的抗菌免疫机制研究

作者：王洁山东师范大学

学位级别：硕士

甘露糖受体(Mannose receptor,MR)为一种含有多个凝集素样结构域的多凝集素受体,能够识别多种末端为甘露糖、海藻糖和N-乙酰葡萄糖胺等残基的糖类分子,结合并清除病原体及内源性分子,参与受体介导的吞噬反应,在参与天然免疫、诱导适应... 详细信息

甘露糖受体(Mannose receptor,MR)为一种含有多个凝集素样结构域的多凝集素受体,能够识别多种末端为甘露糖、海藻糖和N-乙酰葡萄糖胺等残基的糖类分子,结合并清除病原体及内源性分子,参与受体介导的吞噬反应,在参与天然免疫、诱导适应性免疫、调节免疫反应及维持机体组织内环境的稳定等方面发挥重要作用。斑马鱼(Danio rerio)作为模式动物在免疫方面研究中的地位愈发重要。目前斑马鱼中已发现多种甘露糖受体,如MRC1b(Mannose receptor C type 1b),可能与抵抗细菌感染的免疫反应有关,但认识并不全面。本论文的研究中,我们克隆得到一种新型甘露糖受体基因——巨噬细胞甘露糖受体1样基因(Macrophage mannose receptor 1-like,MMR1L),对其天然免疫机制展开研究。MMR1L在进行检测的各斑马鱼正常组织中均有表达,其中在肝胰脏中的相对表达量最高。嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)刺激斑马鱼后,MMR1L在脾脏、鳃和肌肉中的相对表达量显著上调,推测其可能参与细菌引起的天然免疫。原核表达并纯化MMR1L重组蛋白不同结构域,根据结构域的特征,分别命名为:CLECT 1-2、CLECT 3-5、GLD、CLECT6-8、CLECT 9-10、CLECT 11-12。对不同结构域蛋白进行细菌凝集、结合实验,发现MMR1L能够结合并凝集细菌,推测其在抵抗细菌免疫反应中发挥作用。为进一步研究MMR1L发挥抗菌功能的机制,使用String网站预测MMR1L相互作用蛋白,发现TLR2可能为MMR1L的互作蛋白,Pull-down及细胞共定位实验证明MMR1L与TLR2存在相互作用。斑马鱼ZF4细胞系中过表达MMR1L,检测到炎症因子(IL-1β、IL-6、IL-8)、TLR通路重要分子(My D88、TRAF6)、NF-κB(P65/P50)及抗菌肽(Hamp、Defbl1、Defbl3)的相对表达量上调,推测其可能通过与TLR2互作,经TLR信号通路的转导,引起NF-κB信号通路的激活,促进抗菌肽的表达分泌,通过抗菌肽而发挥抗菌免疫功能。构建缺失突变体MMR1L,缺失“GLD”结构域的过表达检测发现,通路中分子表达上调程度低于对照组,说明“GLD”结构域在MMR1L诱导抗菌肽表达过程中起到重要作用。抗菌肽具有广谱的抗菌活性,构建抗菌肽Hamp的缺失突变体。液体抑菌实验表明“KRQS”可能对Hamp抑制细菌生长的反应有重要作用。Hamp(缺失“KRQS”)能够降低对细菌的结合能力,减弱对细菌的凝集。扫描电子显微镜观察嗜水气单胞菌与Hamp、Hamp共孵育的细菌表面结构,发现Hamp对细菌表面结构的破坏程度较Hamp降低,表明“KRQS”在Hamp杀灭细菌过程中发挥重要功能。综上所述,本研究发现MMR1L能够凝集并结合细菌,通过与TLR2协作,激活NF-κB信号通路,诱导通路下游Hamp等抗菌肽表达分泌,进一步实现抗细菌的免疫反应。“GLD”结构域在MMR1L诱导抗菌肽表达功能中起到重要作用;“KRQS”序列可能为Hamp清除细菌功能的重要功能位点。

关键词：斑马鱼 MMR1L NF-κB信号通路铁调素抗菌免疫

粒径差异化Fe3O4纳米酶的合成及其抗菌免疫效应研究

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粒径差异化Fe3O4纳米酶的合成及其抗菌免疫效应研究

作者：宗荣玲扬州大学

学位级别：硕士

频发的细菌感染对畜禽生产、动物养殖以及人类健康等领域造成了巨大损失,临床防治面临的形势越发严峻。抗生素作为常用的抗菌剂,其不合理使用导致的耐药现象越来越普遍,并引发全球健康和经济效益危机。因此,开发新的细菌感染应对方法已... 详细信息

频发的细菌感染对畜禽生产、动物养殖以及人类健康等领域造成了巨大损失,临床防治面临的形势越发严峻。抗生素作为常用的抗菌剂,其不合理使用导致的耐药现象越来越普遍,并引发全球健康和经济效益危机。因此,开发新的细菌感染应对方法已成为当务之急。随着纳米技术的迅速崛起,既具有纳米材料的理化性质,又具有生物酶功能的纳米酶被逐渐被发掘。与传统抗生素不同,纳米酶破坏细菌生物膜导致细菌死亡的同时,不易诱发细菌的耐药性。为了研究纳米酶的尺寸效应、酶活性及抗原捕获能力对抗菌作用及激活机体免疫应答的影响,本研究合成了 3种不同尺寸的Fe3O4纳米颗粒(Ironnanoparticle,IONP),利用 Fe3O4纳米颗粒的过氧化物酶(Peroxidase,POD)活性,催化过氧化氢(Hydrogen peroxide,H2O2)产生·OH用于细菌杀伤。强效的抗菌免疫反应得益于免疫程序各环节的合理设计,本研究探索了不同大小纳米酶对酶活性、抗菌活性、抗原捕获、淋巴结(Lymphnode,LN)转运、树突状细胞(Dendriticcell,DC)内化与成熟、T细胞与B细胞免疫激活这一连续过程的抗菌免疫效应影响,进一步评价其对小鼠皮下脓肿的治疗作用,验证IONP作为抗菌剂及疫苗佐剂对免疫抑制小鼠脓肿疾病模型的影响。具体内容概述如下:(1)水热法合成不同尺寸的IONP后,扫描电镜与透射电镜显示其尺寸分别为50 nm(IONP1)、200nm(IONP2)和400nm(IONP3)左右,大小均匀且呈球形。元素mapping结果显示纳米粒表面均匀分布大量铁元素和氧元素,说明不同尺寸的IONP制备成功。三种IONP表面均带有正电荷,并且其POD活性随着尺寸的增大而减小。利用IONP的POD活性可协同低浓度H2O2高效杀菌,并且IONP可通过静电吸附、氢键和疏水作用力等捕获细菌抗原(称为Ag@IONP)。结果显示,拥有最高酶活性的IONP1相较于IONP2和IONP3能杀灭更多的细菌并捕获更多的细菌抗原。捕获抗原后的IONP粒径均略有增大,表面呈现负电位。(2)本研究进一步研究IONP的细胞摄取作用及其对DC的激活作用。通过ICP-MS检测发现捕获抗原的IONP能够高效被DC摄取,其中Ag@IONP1相较于Ag@IONP2和Ag@IONP3摄取率最高。通过流式细胞术及qPCR分别对DC2.4成熟相关表面标志物及其炎性细胞因子水平进行测定,结果显示Ag@IONP1能显著促进DC的成熟和细胞因子的分泌,显著提升DC成熟相关表面标志物CD80、CD86、CD40、MHC-Ⅱ、CCR7的表达以及炎性细胞因子产生。通过进一步探究纳米粒促进DC成熟的机制,不仅发现细菌抗原捕获能促进DC对抗原的识别与吞噬,Ag@IONP还可通过刺激细胞内ROS的产生进一步活化DC。(3)为研究IONP的体内免疫应答诱导效果,首先检测了 IONP在小鼠体内LN和器官的分布情况,结果显示小尺寸的IONP1能够在24h内大量地在LN和脾脏内积聚。本研究进一步探究不同尺寸IONP的LN转运途径,研究发现IONP1可通过双重转运机制(既利用尺寸优势从患处通过淋巴间质液直接进入LN,被LN常驻DC吞噬;又可募集皮肤迁移DC被其吞噬后转运至LN)高效携带抗原进入LN,并且在免疫抑制下的小鼠皮肤脓肿模型中,有效促进淋巴结DC活化和细胞因子分泌。此外IONP1显著促进IFN-γ和 IL-17的分泌,并提升小鼠的抗体水平,诱导以Th1型为主的免疫反应。(4)为了研究IONP对免疫抑制小鼠皮下脓肿的治疗作用,通过环磷酰胺诱导并皮下接种Methicillin-resistant Staphylococcus aureus(MRSA)建立皮肤脓肿模型,IONP治疗后持续监测小鼠的脓肿大小和体重变化情况,结果显示,IONP1显示出了显著的治疗作用,促进体内细菌的清除与脓肿消退,并具有良好的生物安全性。此外在小鼠脓肿痊愈后再次接种MRSA及异种病原菌(铜绿假单胞菌),IONP的治疗显示出免疫记忆性与免疫记忆的特异性。综上所述,相较于传统抗菌方法,IONP具有长期的免疫保护作用,能够避免同种细菌的反复感染,产生显著的细菌特异性免疫应答,针对易产生复发感染的传染性细菌疾病提供了高效的抗菌方法。

关键词：纳米酶活性氧抗菌免疫脓肿治疗

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中华绒螯蟹GILT蛋白的抗菌免疫机制研究

中华绒螯蟹GILT蛋白的抗菌免疫机制研究

作者：南星羽华东师范大学

学位级别：硕士

作为目前唯一已知定位于溶酶体、吞噬体内的巯基还原酶,γ-干扰素诱导的溶酶体硫醇还原酶(gamma-interferon-inducible lysosomal thiol reductase,GILT)在抗原递呈细胞中组成性表达,并在其他细胞中诱导表达,进而改变细胞氧化还原状态,... 详细信息

作为目前唯一已知定位于溶酶体、吞噬体内的巯基还原酶,γ-干扰素诱导的溶酶体硫醇还原酶(gamma-interferon-inducible lysosomal thiol reductase,GILT)在抗原递呈细胞中组成性表达,并在其他细胞中诱导表达,进而改变细胞氧化还原状态,调节线粒体自噬、磷酸化、细胞增殖等细胞生理功能。此外,GILT能促进CD8T细胞对MHCⅠ类分子限制性抗原的识别,并参与机体的抗病毒免疫反应,甚至改变肿瘤细胞的敏感性。作为IFN–γ的诱导型还原酶,GILT与脊椎动物自身免疫性疾病和肿瘤的限制性感染密切相关,并具有中和细菌感染诱导的胞外病原体,进而清除胞外碎片的免疫功能。但是,无脊椎动物的GILT功能研究尚不明确,目前已知的是病原相关分子模式和细菌均能诱导GILT的高表达,并与革兰氏阴性菌的清除有关。为进一步探究GILT在无脊椎动物中的免疫功能,本论文选取了我国重要特色经济养殖动物—中华绒螯蟹为研究对象,结合该蟹养殖过程中常遭遇细菌性病害的生产实际,对其GILT基因的抗菌功能进行了研究。本论文首先从中华绒螯蟹基因组和转录组中获得并鉴定了GILT的c DNA序列,命名为Es GILT。多序列比对结果表明,Es GILT与其他物种具有较高的序列相似性,且GILT相关特征序列(CQHGX2ECX2NX4C)完全一致。系统发育树结果表明,Es GILT与其他无脊椎动物GILT蛋白处于同一进化分支,呈现进化上的保守性。组织分布结果表明,Es GILT在中华绒螯蟹血细胞和鳃等免疫器官中高表达。细菌感染结果发现,Es GILT在副溶血弧菌和金黄色葡萄球菌感染后6小时的血细胞中出现表达量的显著上调,表明该基因对中华绒螯蟹固有免疫的调控功能。为进一步探究Es GILT的免疫学功能,本论文构建了原核表达r Es GILT蛋白,发现该蛋白在酸性环境中具有硫醇还原酶活性,可催化小鼠Ig G的二硫键还原,且r Es GILT可通过识别副溶血弧菌和金黄色葡萄球菌表面多糖以结合细菌。此外,还发现r Es GILT能够促进血细胞对细菌的凝集效率,提升血细胞对细菌的吞噬能力,抑制血细胞在细菌感染后的凋亡等功能,从而显著提高血细胞对细菌的清除效率。同时中华绒螯蟹血细胞中Es GILT的敲降会导致抗菌肽表达抑制及血淋巴细菌清除能力的下降。综上所述,中华绒螯蟹Es GILT参与抗菌免疫相关途径。通过促进血细胞对细菌的结合、凝集、清除及吞噬作用,抑制细胞凋亡参与细胞免疫应答。并调控抗菌肽表达参与体液免疫应答。该研究揭示了GILT在中华绒螯蟹抗菌免疫反应中的意义,延伸了GILT在甲壳动物先天免疫中的功能研究。

关键词： γ-干扰素 γ-干扰素诱导的溶酶体硫醇还原酶中华绒螯蟹抗菌免疫

COP9信号体亚单元5单体调控中华绒螯蟹血细胞增殖介导抗菌免疫的分子机制研究

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COP9信号体亚单元5单体调控中华绒螯蟹血细胞增殖介导抗菌免疫的...

作者：赵辉华东师范大学

学位级别：硕士

血细胞(Hemocytes)在无脊椎动物中行使免疫细胞的功能,同脊椎动物的血细胞类似,在先天免疫中起到举足轻重的作用。传统观念认为,成熟的循环血细胞缺乏增殖能力,然而在无脊椎动物中进行的单细胞RNA测序结果以及后续的功能研究对这一观点... 详细信息

血细胞(Hemocytes)在无脊椎动物中行使免疫细胞的功能,同脊椎动物的血细胞类似,在先天免疫中起到举足轻重的作用。传统观念认为,成熟的循环血细胞缺乏增殖能力,然而在无脊椎动物中进行的单细胞RNA测序结果以及后续的功能研究对这一观点提出了挑战。COP9信号体(Constitutively photomorphogenic 9 signalosome,CSN)是存在于整个动物界中的保守蛋白复合物,其中COP9信号体亚单元5(COP9 signaling subunit 5,CSN5)较为独特,通常以稳定的单体存在,涉及许多信号传导途径,主要参与细胞周期调节,并能通过调节细胞周期参与调控免疫细胞稳态和免疫应答。然而CSN5在不同物种和细胞之间对于细胞增殖的调控模式具有争议性,其作用机制在无脊椎动物中也尚不明确。鉴于在无脊椎动物中,血细胞增殖和分化动态过程的分子机制在很大程度上是未知的,本论文以中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)这一无脊椎动物代表物种作为研究对象,深入探究了中华绒螯蟹CSN5(EsCSN5)通过调控细胞周期影响血细胞增殖,进而介导宿主抗菌免疫的分子机制。本研究首先使用金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和副溶血性弧菌(Vibrio Parahemolyticus)分别感染了中华绒螯蟹血细胞,同时检测了血细胞的增殖水平,之后通过流式细胞术分选收集得到未增殖的和增殖的血细胞,并对两类细胞亚群的基因表达特性进行了分析。实验结果表明革兰氏阳性菌和阴性菌均能够诱导血细胞增殖,而在增殖细胞中,中华绒螯蟹细胞周期蛋白E(EsCyclin E)显著高表达,Csn5则处于较低的表达水平。鉴于CSN5和Cyclin E在细菌感染引起的中华绒螯蟹血细胞增殖进程中行使着潜在功能,本研究克隆得到了完整的EsCsn5和EsCyclin E的c DNA序列,EsCsn5全长1080bp,开放阅读框包含359个氨基酸;EsCyclin E全长1260bp,开放阅读框包含419个氨基酸。生物信息学分析显示EsCSN5和EsCyclin E符合传统的进化规律,此外结构域所对应的氨基酸序列比对以及三维结构比对结果表明二者具有物种间的高度保守性。实时荧光定量PCR显示EsCsn5和EsCyclin E在中华绒螯蟹含有血细胞的不同组织中均有不同程度的表达。细菌攻毒后,EsCyclin E的表达被显著诱导,同时EsCsn5的表达被显著抑制,暗示上述基因参与了血细胞增殖介导的抗菌免疫的调控。进一步的研究发现,当EsCsn5被敲降时,中华绒螯蟹血细胞的增殖显著增强,表明CSN5在中华绒螯蟹血细胞增殖的负调节中起到关键作用。随后我们发现,EsCSN5在中华绒螯蟹中以复合体和单体两种形式存在,而敲降EsCsn5对复合体的蛋白质表达量的影响十分有限。为了进一步完善EsCSN5调控中华绒螯蟹血细胞增殖介导抗菌免疫的调控模式,将血细胞的细胞周期同质化到G0/G1期,并通过不同时间点EsCyclin E的蛋白表达量将中华绒螯蟹血细胞周期划分为G1早期、G1晚期和S到G2/M期,收集这三个时期的细胞分别沉默EsCsn5,EsCsn8和EsCyclin E检测该调控机制的生效时期。实验结果表明只有在敲降EsCsn5时能够明显加速G1期早期的进程,且仅对此时期有显著影响,暗示该调控路径是EsCyclin E依赖性的,且EsCyclin E是潜在的下游靶点。在此基础上对具体的分子机制进行了探究,在工具细胞HEK293T细胞中同时过表达EsCSN5和EsCyclin E发现EsCyclin E被显著降解,体外泛素化检测证实这种降解是通过泛素化修饰实现的,并且EsCsn5在EsCyclin E的转录调控中没有作用。而共表达EsCSN8和EsCyclin E对EsCyclin E蛋白没有显著影响。此外,EsCyclin E受抑制的中华绒螯蟹存活率显著降低,血淋巴细菌浓度显著上调。因此,EsCSN5单体可以通过在G1期早期泛素化降解EsCyclin E作为血细胞增殖的共同调节因子,以维持活跃的血细胞增殖以及中华绒螯蟹的免疫稳态。综上所述,本研究提供的证据表明,中华绒螯蟹血细胞在细菌感染后抑制EsCSN5单体的表达,导致Cyclin E蛋白在G1期早期大量富集,细胞周期进程加快进而促进细胞增殖,以增强细菌清除能力保护宿主免受感染。本研究首次深入解析了无脊椎动物免疫细胞即成熟循环血细胞增殖的分子机制,并明确了CSN5在甲壳动物中发挥功能的作用方式,为甲壳动物固有免疫机制研究的完善提供了重要的参考意义。

关键词：中华绒螯蟹血细胞增殖 COP9信号体亚单元5 细胞周期蛋白E 抗菌免疫

卵形鲳鲹（Trachinotus ovatus）组织蛋白酶C（TroCTSC）参与机体抗菌免疫的研究

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卵形鲳鲹（Trachinotus ovatus）组织蛋白酶C（TroCTSC）参与机体...

作者：刁倩颖海南大学

学位级别：硕士

组织蛋白酶 C(Cathepsin C,CTSC),又称作二肽基肽酶 Ⅰ(Dipeptidyl peptidase I,DPPI),是主要存在于溶酶体中的一种半胱氨酸蛋白酶,属于番木瓜蛋白酶超家族。它广泛存在于细菌、病毒、原生动物、真菌以及哺乳动物和植物中。CTSC在机体... 详细信息

组织蛋白酶 C(Cathepsin C,CTSC),又称作二肽基肽酶 Ⅰ(Dipeptidyl peptidase I,DPPI),是主要存在于溶酶体中的一种半胱氨酸蛋白酶,属于番木瓜蛋白酶超家族。它广泛存在于细菌、病毒、原生动物、真菌以及哺乳动物和植物中。CTSC在机体不同组织的生理、病理过程中发挥着非常重要的作用,包括细胞内蛋白质降解、细胞生长、神经氨酸酶激活和血小板因子ⅩⅢ激活等等。近年来陆续开展了水生动物CTSC的研究,发现其在机体抗病免疫反应中发挥重要作用。但是,关于硬骨鱼类CTSC如何参与机体抗细菌免疫的机制尚不清楚。鉴于此,本研究以中国南海主要的深水网箱养殖鱼类卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)为研究对象,克隆并鉴定了卵形鲳鲹组织蛋白酶C(TroCTSC)基因,并对其序列结构及抗菌免疫的功能进行了初步研究。主要实验内容以及结果如下:1.克隆获得了 TroCTSC,其编码区长度为1368 bp,编码455个氨基酸,分子量为50.79 kDa,理论等电点为6.27。氨基酸序列分析表明,N端的第1至第20个氨基酸为信号肽序列;第224至第450个氨基酸为木瓜蛋白酶家族半胱氨酸蛋白酶的结构域,其中包含3个活性位点,分别为Cys251、His397和Asn419。同源性比对结果显示TroCTSC与其他物种CTSC具有较高的同源性,为61.01%～90.77%。其中,与高体鰤同源性最高,高达90.77%;同源性最低的为非洲爪蟾(62.25%);与人(60.93%)和小鼠(61.01%)也有较高的同源性。系统进化树分析结果显示,TroCTSC属于硬骨鱼类的一个分支,与同属于鲹科的高体鰤聚成一个分支,亲缘关系最近。2.通过对TroCTSC在健康条件下和细菌刺激后免疫组织的mRNA水平表达进行实时荧光定量PCR分析,发现TroCTSC在健康卵形鲳鲹的11个组织中均有表达,包括皮肤、心脏、肌肉、胃、脾脏、肠、头肾、鳃、肝脏、脑和血,其中血液的表达量最低,将其设置为1,最高表达量的肌肉组织约为59.2倍,其次是肝脏约为33.5倍。哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)感染卵形鲳鲹后,TroCTSC在脾脏、头肾和肝脏中的表达显著上调,其中在感染9 h后肝脏和头肾的表达量达到峰值,脾脏的表达量在感染12 h后达到峰值。说明TroCTSC广泛存在于卵形鲳鲹的各种组织中,在免疫器官中的高表达,提示TroCTSC可能参与机体的抗菌免疫反应。3.为了研究TroCTSC参与机体抗细菌免疫的机制,首先对TroCTSC在细胞中的定位进行了分析。结果显示,在卵形鲳鲹吻细胞(GPS)中TroCTSC主要分布在细胞质,部分存在于细胞质的溶酶体中。进一步研究发现,哈维氏弧菌刺激可促使TroCTSC从细胞质迁移至细胞核,表明细菌刺激可激活TroCTSC发生核易位,从而发挥其功能。4.基于TroCTSC活性位点的分析,成功构建了针对其保守催化活性位点的三个突变体,并诱导表达了 TroCTSC以及三个突变体的的融合蛋白rTroCTSC、rTroCTSC-C251A、rTroCTSC-H397A 和 rTroCTSC-N419A。体外酶活实验使用 CTSC特异性底物(Gly-Phe-β-naphthylamide),结果表明,rTroCTSC的最适pH和温度分别为5.5和40℃。金属离子毒性实验表明,Ca2+、Zn2+能够明显促进rTroCTSC的酶活性,Fe2+和Cu2+能抑制rTroCTSC的酶活性,而Mn2+和Mg2+对rTroCTSC酶活性没有显著抑制或促进作用。与rTroCTSC相比,rTroCTSC-C251A、rTroCTSC-H397A和rTroCTSC-N419A的活性显著降低,表明该活性位点对TroCTSC发挥功能至关重要。5.运用活体实验进一步分析了 TroCTSC参与机体抗细菌免疫的效应。结果表明,当鱼体过量表达TroCTSC后感染哈维氏弧菌,过量表达组在脾脏、头肾和肝脏组织中细菌的数量显著低于对照组,显著提高了机体的抗菌能力。与此相一致的是,当鱼体中干扰表达TroCTSC后,干扰表达组在脾脏、头肾和肝脏组织中细菌的数量显著高与对照组。对免疫相关基因表达研究还发现,TroCTSC过量表达可显著上调各种促炎症细胞因子的mRNA水平,包括IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8,说明TroCTSC可增强机体的抗细菌感染能力。综上所述,本研究克隆并鉴定了卵形鲳鲹TroCTSC,并对其抗细菌免疫进行了研究。结果表明TroCTSC在宿主调节炎症反应、抵抗细菌感染和增强抗菌免疫反应的能力方面具有非常关键的作用,三个活性位点Cys251、His397和Asn419影响TroCTSC酶活。研究结果对进一步了解卵形鲳鲹抗病机制具有重要意义,也为卵形鲳鲹养殖业的绿色健康可持续发展提供了理论基础。

关键词：组织蛋白酶C 卵形鲳鲹哈维氏弧菌抗菌免疫

卵形鲳鲹组织蛋白酶B克隆鉴定及其在抗菌免疫应答中的作用

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卵形鲳鲹组织蛋白酶B克隆鉴定及其在抗菌免疫应答中的作用

作者：沈杨海南大学

学位级别：硕士

组织蛋白酶B(Cathepsin B,CTSB)是半胱氨酸蛋白酶家族中的典型代表之一,同时具有肽链外切酶以及肽链内切酶的活性,在细胞内蛋白质分解代谢中发挥作用,同时在特定条件下还能参与机体其他生理过程,如激素激活、免疫反应中抗原的处理等。目... 详细信息

组织蛋白酶B(Cathepsin B,CTSB)是半胱氨酸蛋白酶家族中的典型代表之一,同时具有肽链外切酶以及肽链内切酶的活性,在细胞内蛋白质分解代谢中发挥作用,同时在特定条件下还能参与机体其他生理过程,如激素激活、免疫反应中抗原的处理等。目前,在硬骨鱼类中有关CTSB的研究相对较少。鉴于此,本研究以卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)为研究对象,克隆了卵形鲳鲹组织蛋白酶B(TroCTSB)基因,并对其进行了生物信息学分析,初步研究其生物学功能。主要实验内容以及结果如下:1.本研究克隆获得了卵形鲳鲹TroCTSB基因序列,并对其进行了生物信息学分析。结果表明,TroCTSB的编码区长度为993bp,编码330个氨基酸,相对分子质量为34 k Da,由信号肽、前导肽以及半胱氨酸蛋白酶结构域3部分组成。同源性比对结果显示,TroCTSB与其它硬骨鱼类及哺乳动物的CTSB具有较高相似性(68.69%～88.48%)。其中与尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)的同源性最高,达88.48%。系统进化树分析的结果显示,TroCTSB与同为鲈形目的尼罗罗非鱼聚为一支,亲缘关系最近。2.组织特异性的结果表明,TroCTSB在健康卵形鲳鲹的11个组织(血液、肝脏、脾脏、头肾、肠、鳃、心、脑、胃、皮肤、肌肉)中均有表达,其中在胃中的表达量最高,其次为肝脏,在血中的表达量最低。迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)感染后,TroCTSB在肝脏、脾脏和头肾中的表达量均显著上调,其中肝脏和头肾在感染后12 h达到峰值,而脾脏在感染后6 h达到峰值,表达量分别上调36.2倍、3.2倍和3.3倍。3.本研究成功构建并诱导表达了TroCTSB的融合蛋白r TroCTSB。体外酶活实验发现,r TroCTSB的最适p H和温度分别为5.5和40℃。金属离子毒性实验表明,Fe、Cu、Ca和Zn均能抑制r TroCTSB的酶活性,其中Zn抑制效果最显著。4.亚细胞定位的结果显示,TroCTSB主要存在于细胞质的溶酶体中;体内抗菌实验的结果表明,当鱼体中过量表达TroCTSB后,可显著提高鱼体的抗菌能力,在E.tarda侵染后,肝脏、脾脏和头肾中的细菌量相比对照组显著降低。相同的是,当干扰鱼体内TroCTSB的表达后,鱼体的抗菌能力显著降低,在E.tarda侵染后,各组织中的细菌量显著增多。体内干扰表达实验发现,当TroCTSB表达量下降后,鱼体凋亡相关基因Tro Blc-2表达量显著上调,而Tro Caspase-3和Tro Caspase-9显著下调。综上所述,本研究的结果表明TroCTSB能增强鱼体的抗菌免疫反应,并在细胞凋亡中发挥着一定的调节作用。本研究为进一步阐明TroCTSB的抗病机制奠定基础,也为卵形鲳鲹养殖业的绿色健康可持续发展提供了新的思路。

关键词：卵形鲳鲹组织蛋白酶B 酶活抗菌免疫凋亡

卵形鲳鲹巨噬细胞迁移抑制因子（MIF）参与机体抗菌免疫反应

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卵形鲳鲹巨噬细胞迁移抑制因子（MIF）参与机体抗菌免疫反应

作者：胡秀聪海南大学

学位级别：硕士

巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)是一类具有独特结构的多效性免疫调节细胞因子,具有类似于酶、趋化因子、激素的功能,可参与机体的细胞增殖、分化、细胞的存活与凋亡等多种生物学过程,是连接非特异性免疫和特异性免疫的关键信号分子。鉴于此... 详细信息

巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)是一类具有独特结构的多效性免疫调节细胞因子,具有类似于酶、趋化因子、激素的功能,可参与机体的细胞增殖、分化、细胞的存活与凋亡等多种生物学过程,是连接非特异性免疫和特异性免疫的关键信号分子。鉴于此,本研究对卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)巨噬细胞迁移抑制因子(TroMIF)进行了克隆鉴定,并对其生物学功能进行了初步研究。研究结果如下:(1)序列分析的结果表明,TroMIF的开放阅读框为345bp,编码115个氨基酸,其相对分子质量为12.3KDa。同源性比对的结果发现,TroMIF与其他硬骨鱼类MIF有很高的同源性为82.61%～95.65%,其中与欧洲舌齿鲈(Dicentrarchus labrax)的同源性最高,为95.65%。序列分析表明TroMIF类似其他物种MIF一样,具有氧化还原活性位点(CALC)、催化活性位点(K)和异构酶活性位点(P)。系统进化分析的结果显示,TroMIF和大黄鱼(Larimichthys crocea)MIF亲缘关系最近。(2)组织特异性的结果表明:TroMIF在健康卵形鲳鲹的11个组织(血液、肝脏、脾脏、头肾、肠、鳃、心、脑、胃、皮肤、肌肉)中均有表达,在肝脏中的表达量最高、头肾中的表达量次之。在迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)感染后,TroMIF在脾脏、头肾中的表达量显著上调,头肾在感染后12h达到峰值,而脾脏在感染后24h达到峰值。本研究成功构建了TroMIF的过量表达载体p CNTroMIF,并合成了特异性的si RNA(si TroMIF),我们将其转染至卵形鲳鲹肾细胞系,然后用E.tarda侵染细胞,实验结果表明:TroMIF过量表达可以显著增强肾细胞抵制病菌侵染的能力,菌落计数结果与对照组相比显著减少;与此一致的是,当si TroMIF干扰肾细胞系中TroMIF的表达后,与对照组相比,si TroMIF组感染E.tarda的数量显著增多。以上实验表明,在卵形鲳鲹抗细菌感染免疫中发挥了重要的作用。(3)为了研究TroMIF的功能,我们构建了原核表达载体并诱导和纯化获得了有活性的重组蛋白r TroMIF。体外实验表明:r TroMIF可以显著抑制头肾淋巴细胞(HKL)和头肾单核细胞(HKM)的迁移;当r TroMIF与HKL进行孵育后,可诱导促进HKL的增殖,并且该诱导呈现剂量依赖性。此外,我们在酶活性检测的实验中发现r TroMIF具有显著的氧化还原酶活性,提示TroMIF可能可以通过其特有的酶活性在抗细菌感染免疫应答中发挥作用。综上所述,TroMIF能提高机体的抗菌免疫反应,通过对TroMIF抗菌免疫反应的研究,为卵形鲳鲹的绿色健康高效养殖提供了新的思路。

关键词：卵形鲳鲹 MIF 细胞迁移氧化还原酶活性抗菌免疫

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日本沼虾SVWC参与抗菌免疫反应

日本沼虾SVWC参与抗菌免疫反应

作者：孙鹤鹤河北大学

学位级别：硕士

日本沼虾(Macrobrachium nipponense)在我国是重要的淡水养殖虾类,具有重要经济价值。随着水体环境恶化和高密度养殖方法的广泛使用,使得淡水虾类病害频繁爆发,每年都会造成严重的经济损失。日本沼虾作为淡水虾类的代表,对其免疫系统尤... 详细信息

日本沼虾(Macrobrachium nipponense)在我国是重要的淡水养殖虾类,具有重要经济价值。随着水体环境恶化和高密度养殖方法的广泛使用,使得淡水虾类病害频繁爆发,每年都会造成严重的经济损失。日本沼虾作为淡水虾类的代表,对其免疫系统尤其是抗菌免疫的分子机制进行研究具有十分重要的意义。SVWC(Single domain von Willebrand factor type C)蛋白家族是在无脊椎动物体内发现的含有8个保守的半胱氨酸结构的小分子蛋白家族。有研究表明,SVWC蛋白对机体应对环境刺激、营养状态变化、病毒感染以及细菌刺激具有重要的作用。但之前关于SVWC蛋白的研究主要集中在SVWC帮助机体抵抗病毒感染,对SVWC参与机体的抗菌免疫功能方面的研究却鲜有报道。本研究结合日本沼虾转录组数据,筛选出一条SVWC基因,将其命名为MnSVWC,对MnSVWC参与日本沼虾抗菌免疫功能进行研究。研究成果如下:1、利用qPCR方法对MnSVWC mRNA的组织分布及维氏气单胞菌刺激下的表达模式进行了分析。结果显示,MnSVWC在日本沼虾的鳃组织和血细胞中表达量最高,且受维氏气单胞菌刺激后表达显著上调。2、利用大肠杆菌原核表达系统成功对MnSVWC进行了重组表达,并对表达产物rMnSVWC进行了纯化。体外实验发现,rMnSVWC在钙离子存在的情况下使大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)以及维氏气单胞菌(Aeromonas virginia)发生凝集反应;利用Western blot方法证实rMnSVWC可以和这4种细菌发生结合;体外溶菌实验和电镜观察发现rMnSVWC不存在直接杀菌活性。3、将细菌与rMnSVWC共孵育后注射到日本沼虾体内,检测发现rMnSVWC可以明显促进沼虾对细菌的清除能力;RNAi敲低MnSVWC的表达后,日本沼虾对细菌的清除能力显著下降。4、利用免疫荧光技术并结合共聚焦显微镜,我们发现rMnSVWC能结合于日本沼虾血细胞表面,并促进血细胞对细菌的吞噬。

关键词：日本沼虾 SVWC 细菌凝集细菌结合吞噬抗菌免疫