日本沼虾SVWC参与抗菌免疫反应

作     者：孙鹤鹤 

作者单位：河北大学 

学位级别：硕士

导师姓名：柳峰松;唐婷

授予年度：2019年

学科分类：0908[农学-水产] 09[农学] 

主      题：日本沼虾 SVWC 细菌凝集 细菌结合 吞噬 抗菌免疫 

摘      要：日本沼虾(Macrobrachium nipponense)在我国是重要的淡水养殖虾类,具有重要经济价值。随着水体环境恶化和高密度养殖方法的广泛使用,使得淡水虾类病害频繁爆发,每年都会造成严重的经济损失。日本沼虾作为淡水虾类的代表,对其免疫系统尤其是抗菌免疫的分子机制进行研究具有十分重要的意义。SVWC(Single domain von Willebrand factor type C)蛋白家族是在无脊椎动物体内发现的含有8个保守的半胱氨酸结构的小分子蛋白家族。有研究表明,SVWC蛋白对机体应对环境刺激、营养状态变化、病毒感染以及细菌刺激具有重要的作用。但之前关于SVWC蛋白的研究主要集中在SVWC帮助机体抵抗病毒感染,对SVWC参与机体的抗菌免疫功能方面的研究却鲜有报道。本研究结合日本沼虾转录组数据,筛选出一条SVWC基因,将其命名为MnSVWC,对MnSVWC参与日本沼虾抗菌免疫功能进行研究。研究成果如下:1、利用qPCR方法对MnSVWC mRNA的组织分布及维氏气单胞菌刺激下的表达模式进行了分析。结果显示,MnSVWC在日本沼虾的鳃组织和血细胞中表达量最高,且受维氏气单胞菌刺激后表达显著上调。2、利用大肠杆菌原核表达系统成功对MnSVWC进行了重组表达,并对表达产物rMnSVWC进行了纯化。体外实验发现,rMnSVWC在钙离子存在的情况下使大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)以及维氏气单胞菌(Aeromonas virginia)发生凝集反应;利用Western blot方法证实rMnSVWC可以和这4种细菌发生结合;体外溶菌实验和电镜观察发现rMnSVWC不存在直接杀菌活性。3、将细菌与rMnSVWC共孵育后注射到日本沼虾体内,检测发现rMnSVWC可以明显促进沼虾对细菌的清除能力;RNAi敲低MnSVWC的表达后,日本沼虾对细菌的清除能力显著下降。4、利用免疫荧光技术并结合共聚焦显微镜,我们发现rMnSVWC能结合于日本沼虾血细胞表面,并促进血细胞对细菌的吞噬。