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svwc在家蝇抗菌免疫中的作用

SVWC在家蝇抗菌免疫中的作用

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作者：王蕊蕊河北大学

学位级别：硕士

先天免疫(Innate immunity)是无脊椎动物的主要免疫途径。无脊椎动物依赖模式识别受体(Pattern Recognition Receptors,PRRs)精准地实现自我/非我识别,这是宿主防御病原体的基本步骤,也是触发免疫反应的关键。Single von Willebrand fac... 详细信息

先天免疫(Innate immunity)是无脊椎动物的主要免疫途径。无脊椎动物依赖模式识别受体(Pattern Recognition Receptors,PRRs)精准地实现自我/非我识别,这是宿主防御病原体的基本步骤,也是触发免疫反应的关键。Single von Willebrand factor C-domain proteins(svwc)是最近发现于节肢动物中的蛋白家族,其特征是具有单一的von Willebrand因子C(VWC)型结构域。在标准的哺乳动物VWC结构域中具有10个保守的半胱氨酸残基,而svwc只含有其中8个半胱氨酸残基。有报道svwc家族成员能应答细菌刺激和营养状况改变时等环境胁迫而做出反应。本研究以家蝇(Musca domestica)为主要研究对象,鉴定了一个新的svwc基因,命名为MdsvwcIA-1,RNAseq显示家蝇幼虫MdsvwcIA-1在细菌刺激后显著上调,提示MdsvwcIA-1可能参与家蝇抗菌免疫,但是作用机制并不明晰。因此,本研究对家蝇svwc家族进行系统的生物信息学分析,并从基因水平与蛋白水平探究MdsvwcIA-1在家蝇先天免疫中的功能。研究成果如下:1.生物信息学分析发现MdsvwcIA-1为小分子分泌型蛋白,并具有svwc结构域及其8个保守半胱氨酸残基。2.基于qPCR的空间表达谱分析发现,MdsvwcIA-1主要在幼虫脂肪体和肠道中表达;受到细菌Escherichia coli或Staphylococcus aureus刺激后,幼虫体内MdsvwcIA-1转录水平显著升高。3.利用RNAi技术敲低幼虫MdsvwcIA-1表达,并注射细菌进行免疫刺激。干扰组较对照组(dsGFP)幼虫存活率和酚氧化酶活性降低,同时抗菌肽(muscin,diptericin,attacin,cecropin)基因和NF-κB样转录因子(dorsal)基因的表达水平也显著降低,提示MdsvwcIA-1对体液免疫具有调控作用。4.利用大肠杆菌表达系统获得重组蛋白rMdsvwcIA-1。将rMdsvwcIA-1与E.coli包被后注射到家蝇体内,机体内清除细菌的能力显著增强。体外实验发现rMdsvwcIA-1具有结合细菌和酵母的活性、Ca依赖的凝集活性以及调理血细胞吞噬活性。进一步的ELISA实验证实rMdsvwcIA-1对LPS、Lys-PGN、DAP-PGN、D-半乳糖、D-甘露聚糖、β-1,3-葡聚糖等具有广谱的结合能力。免疫荧光实验发现,rMdsvwcIA-1能够结合于血细胞表面,推测血细胞膜上存在MdsvwcIA-1的特异识别的受体,与MdsvwcIA-1一起调控吞噬作用。综上研究结果,我们认为MdsvwcIA-1可能是一种新型的模式识别受体,通过结合PAMP介导病原识别,进而通过凝集反应、调理吞噬和促进抗菌肽合成等功能参与细胞免疫和体液免疫调控,在宿主抗菌免疫过程中发挥作用。

关键词：家蝇 svwc 先天免疫模式识别受体

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日本沼虾svwc参与抗菌免疫反应

日本沼虾SVWC参与抗菌免疫反应

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作者：孙鹤鹤河北大学

学位级别：硕士

日本沼虾(Macrobrachium nipponense)在我国是重要的淡水养殖虾类,具有重要经济价值。随着水体环境恶化和高密度养殖方法的广泛使用,使得淡水虾类病害频繁爆发,每年都会造成严重的经济损失。日本沼虾作为淡水虾类的代表,对其免疫系统尤... 详细信息

日本沼虾(Macrobrachium nipponense)在我国是重要的淡水养殖虾类,具有重要经济价值。随着水体环境恶化和高密度养殖方法的广泛使用,使得淡水虾类病害频繁爆发,每年都会造成严重的经济损失。日本沼虾作为淡水虾类的代表,对其免疫系统尤其是抗菌免疫的分子机制进行研究具有十分重要的意义。svwc(Single domain von Willebrand factor type C)蛋白家族是在无脊椎动物体内发现的含有8个保守的半胱氨酸结构的小分子蛋白家族。有研究表明,svwc蛋白对机体应对环境刺激、营养状态变化、病毒感染以及细菌刺激具有重要的作用。但之前关于svwc蛋白的研究主要集中在svwc帮助机体抵抗病毒感染,对svwc参与机体的抗菌免疫功能方面的研究却鲜有报道。本研究结合日本沼虾转录组数据,筛选出一条svwc基因,将其命名为Mnsvwc,对Mnsvwc参与日本沼虾抗菌免疫功能进行研究。研究成果如下:1、利用qPCR方法对Mnsvwc mRNA的组织分布及维氏气单胞菌刺激下的表达模式进行了分析。结果显示,Mnsvwc在日本沼虾的鳃组织和血细胞中表达量最高,且受维氏气单胞菌刺激后表达显著上调。2、利用大肠杆菌原核表达系统成功对Mnsvwc进行了重组表达,并对表达产物rMnsvwc进行了纯化。体外实验发现,rMnsvwc在钙离子存在的情况下使大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)以及维氏气单胞菌(Aeromonas virginia)发生凝集反应;利用Western blot方法证实rMnsvwc可以和这4种细菌发生结合;体外溶菌实验和电镜观察发现rMnsvwc不存在直接杀菌活性。3、将细菌与rMnsvwc共孵育后注射到日本沼虾体内,检测发现rMnsvwc可以明显促进沼虾对细菌的清除能力;RNAi敲低Mnsvwc的表达后,日本沼虾对细菌的清除能力显著下降。4、利用免疫荧光技术并结合共聚焦显微镜,我们发现rMnsvwc能结合于日本沼虾血细胞表面,并促进血细胞对细菌的吞噬。

关键词：日本沼虾 svwc 细菌凝集细菌结合吞噬抗菌免疫

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