卵形鲳鲹组织蛋白酶B克隆鉴定及其在抗菌免疫应答中的作用

作     者：沈杨 

作者单位：海南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：秦启伟;孙云

授予年度：2021年

学科分类：0908[农学-水产] 09[农学] 

主      题：卵形鲳鲹 组织蛋白酶B 酶活 抗菌免疫 凋亡 

摘      要：组织蛋白酶B(Cathepsin B,CTSB)是半胱氨酸蛋白酶家族中的典型代表之一,同时具有肽链外切酶以及肽链内切酶的活性,在细胞内蛋白质分解代谢中发挥作用,同时在特定条件下还能参与机体其他生理过程,如激素激活、免疫反应中抗原的处理等。目前,在硬骨鱼类中有关CTSB的研究相对较少。鉴于此,本研究以卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)为研究对象,克隆了卵形鲳鲹组织蛋白酶B(TroCTSB)基因,并对其进行了生物信息学分析,初步研究其生物学功能。主要实验内容以及结果如下:1.本研究克隆获得了卵形鲳鲹TroCTSB基因序列,并对其进行了生物信息学分析。结果表明,TroCTSB的编码区长度为993bp,编码330个氨基酸,相对分子质量为34 k Da,由信号肽、前导肽以及半胱氨酸蛋白酶结构域3部分组成。同源性比对结果显示,TroCTSB与其它硬骨鱼类及哺乳动物的CTSB具有较高相似性(68.69%～88.48%)。其中与尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)的同源性最高,达88.48%。系统进化树分析的结果显示,TroCTSB与同为鲈形目的尼罗罗非鱼聚为一支,亲缘关系最近。2.组织特异性的结果表明,TroCTSB在健康卵形鲳鲹的11个组织(血液、肝脏、脾脏、头肾、肠、鳃、心、脑、胃、皮肤、肌肉)中均有表达,其中在胃中的表达量最高,其次为肝脏,在血中的表达量最低。迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)感染后,TroCTSB在肝脏、脾脏和头肾中的表达量均显著上调,其中肝脏和头肾在感染后12 h达到峰值,而脾脏在感染后6 h达到峰值,表达量分别上调36.2倍、3.2倍和3.3倍。3.本研究成功构建并诱导表达了TroCTSB的融合蛋白r TroCTSB。体外酶活实验发现,r TroCTSB的最适p H和温度分别为5.5和40℃。金属离子毒性实验表明,Fe、Cu、Ca和Zn均能抑制r TroCTSB的酶活性,其中Zn抑制效果最显著。4.亚细胞定位的结果显示,TroCTSB主要存在于细胞质的溶酶体中;体内抗菌实验的结果表明,当鱼体中过量表达TroCTSB后,可显著提高鱼体的抗菌能力,在***侵染后,肝脏、脾脏和头肾中的细菌量相比对照组显著降低。相同的是,当干扰鱼体内TroCTSB的表达后,鱼体的抗菌能力显著降低,在***侵染后,各组织中的细菌量显著增多。体内干扰表达实验发现,当TroCTSB表达量下降后,鱼体凋亡相关基因Tro Blc-2表达量显著上调,而Tro Caspase-3和Tro Caspase-9显著下调。综上所述,本研究的结果表明TroCTSB能增强鱼体的抗菌免疫反应,并在细胞凋亡中发挥着一定的调节作用。本研究为进一步阐明TroCTSB的抗病机制奠定基础,也为卵形鲳鲹养殖业的绿色健康可持续发展提供了新的思路。