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粒径差异化Fe3O4纳米酶的合成及其抗菌免疫效应研究

粒径差异化Fe3O4纳米酶的合成及其抗菌免疫效应研究

作     者:宗荣玲 

作者单位:扬州大学 

学位级别:硕士

导师姓名:陈刚;宋瑞龙;姜逸

授予年度:2023年

学科分类:090602[农学-预防兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题:纳米酶 活性氧 抗菌免疫 脓肿治疗 

摘      要:频发的细菌感染对畜禽生产、动物养殖以及人类健康等领域造成了巨大损失,临床防治面临的形势越发严峻。抗生素作为常用的抗菌剂,其不合理使用导致的耐药现象越来越普遍,并引发全球健康和经济效益危机。因此,开发新的细菌感染应对方法已成为当务之急。随着纳米技术的迅速崛起,既具有纳米材料的理化性质,又具有生物酶功能的纳米酶被逐渐被发掘。与传统抗生素不同,纳米酶破坏细菌生物膜导致细菌死亡的同时,不易诱发细菌的耐药性。为了研究纳米酶的尺寸效应、酶活性及抗原捕获能力对抗菌作用及激活机体免疫应答的影响,本研究合成了 3种不同尺寸的Fe3O4纳米颗粒(Ironnanoparticle,IONP),利用 Fe3O4纳米颗粒的过氧化物酶(Peroxidase,POD)活性,催化过氧化氢(Hydrogen peroxide,H2O2)产生·OH用于细菌杀伤。强效的抗菌免疫反应得益于免疫程序各环节的合理设计,本研究探索了不同大小纳米酶对酶活性、抗菌活性、抗原捕获、淋巴结(Lymphnode,LN)转运、树突状细胞(Dendriticcell,DC)内化与成熟、T细胞与B细胞免疫激活这一连续过程的抗菌免疫效应影响,进一步评价其对小鼠皮下脓肿的治疗作用,验证IONP作为抗菌剂及疫苗佐剂对免疫抑制小鼠脓肿疾病模型的影响。具体内容概述如下:(1)水热法合成不同尺寸的IONP后,扫描电镜与透射电镜显示其尺寸分别为50 nm(IONP1)、200nm(IONP2)和400nm(IONP3)左右,大小均匀且呈球形。元素mapping结果显示纳米粒表面均匀分布大量铁元素和氧元素,说明不同尺寸的IONP制备成功。三种IONP表面均带有正电荷,并且其POD活性随着尺寸的增大而减小。利用IONP的POD活性可协同低浓度H2O2高效杀菌,并且IONP可通过静电吸附、氢键和疏水作用力等捕获细菌抗原(称为Ag@IONP)。结果显示,拥有最高酶活性的IONP1相较于IONP2和IONP3能杀灭更多的细菌并捕获更多的细菌抗原。捕获抗原后的IONP粒径均略有增大,表面呈现负电位。(2)本研究进一步研究IONP的细胞摄取作用及其对DC的激活作用。通过ICP-MS检测发现捕获抗原的IONP能够高效被DC摄取,其中Ag@IONP1相较于Ag@IONP2和Ag@IONP3摄取率最高。通过流式细胞术及qPCR分别对DC2.4成熟相关表面标志物及其炎性细胞因子水平进行测定,结果显示Ag@IONP1能显著促进DC的成熟和细胞因子的分泌,显著提升DC成熟相关表面标志物CD80、CD86、CD40、MHC-Ⅱ、CCR7的表达以及炎性细胞因子产生。通过进一步探究纳米粒促进DC成熟的机制,不仅发现细菌抗原捕获能促进DC对抗原的识别与吞噬,Ag@IONP还可通过刺激细胞内ROS的产生进一步活化DC。(3)为研究IONP的体内免疫应答诱导效果,首先检测了 IONP在小鼠体内LN和器官的分布情况,结果显示小尺寸的IONP1能够在24h内大量地在LN和脾脏内积聚。本研究进一步探究不同尺寸IONP的LN转运途径,研究发现IONP1可通过双重转运机制(既利用尺寸优势从患处通过淋巴间质液直接进入LN,被LN常驻DC吞噬;又可募集皮肤迁移DC被其吞噬后转运至LN)高效携带抗原进入LN,并且在免疫抑制下的小鼠皮肤脓肿模型中,有效促进淋巴结DC活化和细胞因子分泌。此外IONP1显著促进IFN-γ和 IL-17的分泌,并提升小鼠的抗体水平,诱导以Th1型为主的免疫反应。(4)为了研究IONP对免疫抑制小鼠皮下脓肿的治疗作用,通过环磷酰胺诱导并皮下接种Methicillin-resistant Staphylococcus aureus(MRSA)建立皮肤脓肿模型,IONP治疗后持续监测小鼠的脓肿大小和体重变化情况,结果显示,IONP1显示出了显著的治疗作用,促进体内细菌的清除与脓肿消退,并具有良好的生物安全性。此外在小鼠脓肿痊愈后再次接种MRSA及异种病原菌(铜绿假单胞菌),IONP的治疗显示出免疫记忆性与免疫记忆的特异性。综上所述,相较于传统抗菌方法,IONP具有长期的免疫保护作用,能够避免同种细菌的反复感染,产生显著的细菌特异性免疫应答,针对易产生复发感染的传染性细菌疾病提供了高效的抗菌方法。

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