斑马鱼MMR1L基因的抗菌免疫机制研究

作     者：王洁 

作者单位：山东师范大学 

学位级别：硕士

导师姓名：杨慧婷

授予年度：2023年

学科分类：0908[农学-水产] 09[农学] 

主      题：斑马鱼 MMR1L NF-κB信号通路 铁调素 抗菌免疫 

摘      要：甘露糖受体(Mannose receptor,MR)为一种含有多个凝集素样结构域的多凝集素受体,能够识别多种末端为甘露糖、海藻糖和N-乙酰葡萄糖胺等残基的糖类分子,结合并清除病原体及内源性分子,参与受体介导的吞噬反应,在参与天然免疫、诱导适应性免疫、调节免疫反应及维持机体组织内环境的稳定等方面发挥重要作用。斑马鱼(Danio rerio)作为模式动物在免疫方面研究中的地位愈发重要。目前斑马鱼中已发现多种甘露糖受体,如MRC1b(Mannose receptor C type 1b),可能与抵抗细菌感染的免疫反应有关,但认识并不全面。本论文的研究中,我们克隆得到一种新型甘露糖受体基因——巨噬细胞甘露糖受体1样基因(Macrophage mannose receptor 1-like,MMR1L),对其天然免疫机制展开研究。MMR1L在进行检测的各斑马鱼正常组织中均有表达,其中在肝胰脏中的相对表达量最高。嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)刺激斑马鱼后,MMR1L在脾脏、鳃和肌肉中的相对表达量显著上调,推测其可能参与细菌引起的天然免疫。原核表达并纯化MMR1L重组蛋白不同结构域,根据结构域的特征,分别命名为:CLECT 1-2、CLECT 3-5、GLD、CLECT6-8、CLECT 9-10、CLECT 11-12。对不同结构域蛋白进行细菌凝集、结合实验,发现MMR1L能够结合并凝集细菌,推测其在抵抗细菌免疫反应中发挥作用。为进一步研究MMR1L发挥抗菌功能的机制,使用String网站预测MMR1L相互作用蛋白,发现TLR2可能为MMR1L的互作蛋白,Pull-down及细胞共定位实验证明MMR1L与TLR2存在相互作用。斑马鱼ZF4细胞系中过表达MMR1L,检测到炎症因子(IL-1β、IL-6、IL-8)、TLR通路重要分子(My D88、TRAF6)、NF-κB(P65/P50)及抗菌肽(Hamp、Defbl1、Defbl3)的相对表达量上调,推测其可能通过与TLR2互作,经TLR信号通路的转导,引起NF-κB信号通路的激活,促进抗菌肽的表达分泌,通过抗菌肽而发挥抗菌免疫功能。构建缺失突变体MMR1L,缺失“GLD结构域的过表达检测发现,通路中分子表达上调程度低于对照组,说明“GLD结构域在MMR1L诱导抗菌肽表达过程中起到重要作用。抗菌肽具有广谱的抗菌活性,构建抗菌肽Hamp的缺失突变体。液体抑菌实验表明“KRQS可能对Hamp抑制细菌生长的反应有重要作用。Hamp(缺失“KRQS)能够降低对细菌的结合能力,减弱对细菌的凝集。扫描电子显微镜观察嗜水气单胞菌与Hamp、Hamp共孵育的细菌表面结构,发现Hamp对细菌表面结构的破坏程度较Hamp降低,表明“KRQS在Hamp杀灭细菌过程中发挥重要功能。综上所述,本研究发现MMR1L能够凝集并结合细菌,通过与TLR2协作,激活NF-κB信号通路,诱导通路下游Hamp等抗菌肽表达分泌,进一步实现抗细菌的免疫反应。“GLD结构域在MMR1L诱导抗菌肽表达功能中起到重要作用;“KRQS序列可能为Hamp清除细菌功能的重要功能位点。