中华绒螯蟹Ficolin蛋白抗菌免疫的机制研究

作     者：赵钶 

作者单位：华东师范大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王群

授予年度：2023年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 071002[理学-动物学] 

主      题：Ficolin 纤维蛋白原相关蛋白 中华绒螯蟹 模式识别受体 抗菌免疫 

摘      要：Ficolin是纤维蛋白原相关蛋白家族(FREPs)成员,在脊椎动物和无脊椎动物中作为一种新型凝集素发挥模式识别受体(PRR)的作用。在脊椎动物中,Ficolins是由三个多肽链构成的寡聚蛋白,通过其胶原蛋白样结构域组装成同源三聚体而构成亚基。其中一些Ficolin是血清凝集素,可以与甘露聚糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶(MASPs)和小甘露聚糖凝集素(MBL)相关蛋白(s MAP)形成复合物,该复合物通过凝集素途径激活补体。在无脊椎动物中,Ficolin具有一个C端保守的纤维蛋白原相关结构域(FRe D),但其N端结构大不相同甚至未知,已知部分Ficolin具有一段卷曲螺旋结构(coiled coil),可能够促使多肽链形成类似哺乳动物Ficolin三聚体寡聚蛋白的作用。无脊椎动物Ficolin在功能上从两种途径发挥作用,一是发挥类似模式识别受体的凝集素作用,它能够识别入侵病原体PAMPs以促进对入侵病原体的清除,从而保护宿主免受感染;二是原始的调理吞噬作用,其作为一种调理素促进血细胞对病原微生物的吞噬作用以达到清除细菌的目的。本论文以中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)为研究对象,探究了Ficolin在调控中华绒螯蟹先天免疫的作用机制。基于中华绒螯蟹全基因组数据库和甲壳动物Ficolin基因序列,搜索和比对出了一种Ficolin同源物,并将其命名为EsFicolin。通过生物信息学分析,发现其具有一个信号肽,一个高度保守的C端纤维蛋白原相关结构域(FRe D)和用于三聚体形成的卷曲螺旋结构。多序列比对的结果证实C端FRe D结构域与其他甲壳动物FRe D结构域相似度极高,表明其在进化上高度保守,是重要的功能域结构。系统发育树的结果表明,EsFicolin与哺乳动物Ficolin聚为一支,而不与甲壳动物聚为一支,暗示EsFicolin在功能上与哺乳动物Ficolin的相似之处。RT-q PCR分析组织分布的结果表明,EsFicolin在肌肉、肝胰腺、肠道、胃和血细胞中均有表达,表明EsFicolin参与较为广泛的生理功能。受金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和副溶血弧菌(Vibrio Parahaemolyticus)刺激后,与对照组相比,EsFicolin在血细胞中显著上调,表明其与抗菌免疫反应的潜在关联。利用大肠杆菌原核表达系统表达和纯化了重组蛋白r EsFicolin,随后的化学交联实验证实重组的r EsFicolin蛋白在双(3-磺基-N-羟基琥珀酰亚胺酯)辛二酸酯钠盐(BS)存在的情况下,可以形成三聚体寡聚结构,Westren blot结果显示三聚体蛋白对应的条带与单体蛋白对应的条带相比,明显更粗颜色更深,表明三聚体寡聚蛋白数量大于单体蛋白数量,大部分蛋白质均以三聚体的结构存在。为了探究r EsFicolin能否发挥凝集素的作用,我们的凝集试验表明,r EsFicolin对金黄色葡萄球菌和副溶血弧菌均有很强的凝集活性,且对于革兰氏阴性菌的凝集活性更强。结合实验显示,r EsFicolin对五种革兰氏阴性菌和三种革兰氏阳性菌均具有结合能力,且对革兰氏阴性菌的结合能力更强。后续的多糖结合实验显示r EsFicolin以剂量依赖性的方式与细胞表明病原相关分子模式(PAMPs)结合,揭示了其识别并结合细菌的具体机制。深入研究发现,重组r EsFicolin蛋白可有效去除细菌,并表现出直接抗菌活性。r EsFicolin还可以促进血细胞的吞噬作用以增强细菌清除率。综上所述,EsFicolin作为中华绒螯蟹先天免疫系统中的一种模式识别受体,能够识别细胞表明病原相关分子模式(PAMPs)并凝集和结合细菌。其对抗入侵微生物的途径主要有两种:一方面,EsFicolin具有直接抑制细菌生长的活性,另一方面,发挥调理素的作用,促进中华绒螯蟹血细胞对细菌的吞噬作用,以达到清除细菌,保护宿主免受病原体感染的目的。这些发现表明EsFicolin在中华绒螯蟹的抗菌免疫反应中起着重要作用,本论文丰富了我们对于无脊椎动物Ficolin的功能研究,增强了我们对于无脊椎动物先天免疫系统的认知。