肝素酶可变剪接体Splice5与Splice9＆10的亚细胞定位及Splice9＆10的增殖、成瘤性研究

作     者：顾懿 

作者单位：广西医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：宫锋

授予年度：2013年

学科分类：0710[理学-生物学] 071010[理学-生物化学与分子生物学] 081704[工学-应用化学] 07[理学] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 

主      题：肝素酶 选择性剪接 稳定转染 亚细胞定位 增殖 成瘤性 

摘      要：肝素酶（heparanase, HPSE）是一种β-葡萄糖苷内切酶,可特异性的识别和降解硫酸肝素蛋白多糖的硫酸肝素侧链,破坏基底膜和细胞外基质,并释放各种细胞因子,促进肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移。由于肝素酶在肿瘤发生发展中起着重要的作用,近来年,许多学者将肝素酶运用于临床肿瘤治疗,作为肿瘤治疗的靶标。 选择性剪接（Alternative splicing）是指通过选择性地剪接前体mRNA中不同的剪接位点,由一条前体mRNA生成多种不同的成熟mRNA的过程。选择性剪接是增加蛋白质多样性与基因表达复杂性的主要原因,是机体满足各种发育阶段、各种生理环境需要的重要调控机制。 关于人类肝素酶可变剪接体,目前主要有Nasser等报道的Splice5和Barash等报道的T5。 研究证明T5并没有肝素酶活性,但其具有促进骨髓瘤细胞体外增殖的功能。将T5转染CAG. FaDu、293等细胞,都有同样的结果。将稳定转染T5的细胞皮下注射裸鼠,建立肿瘤移植模型,发现它具有促进肿瘤的生长和肿瘤血管生成的功能。 Nasser等构建了稳定转染肝素酶可变剪接体Splice5的U87细胞,细胞定位研究显示,这种肝素酶可变剪接体的细胞定位与全长肝素酶不同,肝素酶全长以颗粒状分布于细胞质中,Splice5呈弥散状分布于细胞质中。关于Splice5的其他生物学功能还未见文献发表。 本课题的目的是筛选肝素酶可变剪接体稳定细胞株,并研究其亚细胞定位以及增殖性、成瘤性等功能,为进一步明确肝素酶在肿瘤发生转移中的作用和肿瘤的治疗提供新的思路。 本研究主要包括四个方面： 一、肝素酶可变剪接体splice5和splice9＆10的稳定转染 目的建立肝素酶可变剪接体splice5和splice9＆10细胞系,为研究splice5和splice9＆10的生物学功能打下基础。 方法用转染试剂,将肝素酶可变剪接体splice5和splice9＆10转入CHO细胞或MCF-7细胞,再用G418筛选得到高表达的稳定株。最后采用RT-PCR技术、Western blot检测转染后的基因表达情况。 结果成功培养了稳定转染肝素酶可变剪接体splice5和splice9＆10细胞株在荧光显微镜下观察细胞生长状态良好。 结论建立了稳定转染Splice5、Splice9＆10的细胞株,可做为研究可变剪接体功能研究的一种体外模型。 二、肝素酶可变剪接体splice5和splice9＆10的亚细胞定位 目的比较肝素酶可变剪接体splice5和splice9＆10与野生型肝素酶的不同,预测其可能与全长肝素酶功能的不同 方法将稳定转染的肝素酶可变剪接体分别用高尔基体、溶酶体、细胞膜、内质网红色荧光探针染色,然后通过激光共聚焦显微镜观察绿色荧光蛋白与各细胞器染料的重合区域确定肝素酶可变剪接体的亚细胞定位。 结果野生型肝素酶在溶酶体、高尔基体、细胞膜、内质网中均有分布。同样,Splice5和Splice9＆10也显示了同样的定位特性。但野生型肝素酶在细胞质中呈颗粒状,Splice5和Splice9＆10在细胞质中呈弥散状。 结论Splice5、Splice9＆10和野生型肝素酶在CHO细胞或MCF-7细胞中分布的形式的不同提示,Splice5、Splice9＆10可能具有其他的生物学功能。 三、肝素酶可变剪接体Splice9＆10的增殖活性研究。 目的研究稳定转染肝素酶可变剪接体Splice9＆10的MCF-7细胞株体外增殖的特性。 方法采用MTT法、细胞集落形成法检测肝素酶可变剪接体Splice9＆10对MCF-7细胞在体外的增殖情况。 结果对肿瘤体外增值数据进行统计学分析,结果表明稳定转染肝素酶可变剪接体Splice9＆10组比稳定转染肝素酶全长组细胞增长快,具有统计学意义。 结论肝素酶可变剪接体Splice9＆10具有增强MCF-7细胞体外增殖的功能。 四、肝素酶可变剪接体Splice9＆10的成瘤性研究 目的建立肝素酶可变剪接体Splice9＆10肿瘤移植模型,研究其成瘤性。 方法将Nod-scid小鼠,随机分成两组,肌肉注射雌激素,1mg/只,7天注射一次。开始注射雌激素2周后,将培养的稳定表达肝素酶可变剪接体splice9＆10和全长肝素酶细胞株,皮下注射小鼠,每只5×106个细胞建立Nod-scid皮下移植肿瘤模型,一周测肿瘤2次,并绘制肿瘤生长曲线。6周后处死小鼠,剥离肿瘤,称重、拍照。 结果将肿瘤体外增值数据进行统计学分析,splice9＆10组比肝素酶全长组肿瘤生长快。 结论splic