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电化学发光法检测DNA的氧化损伤

电化学发光法检测DNA的氧化损伤

引用

作者：梁霞霞成都理工大学

学位级别：硕士

生物体内的氧化应激反应是由于活性氧和抗氧化防御途径不平衡所致。生物体内的DNA、脂类和蛋白质经常暴露在活性氧类物质,如羟基自由基(OH·)、超氧阴离子(O)、单线态氧(O)和过氧化物(HOO)中。这些物质可以氧化DNA造成多种损伤,包括碱... 详细信息

生物体内的氧化应激反应是由于活性氧和抗氧化防御途径不平衡所致。生物体内的DNA、脂类和蛋白质经常暴露在活性氧类物质,如羟基自由基(OH·)、超氧阴离子(O)、单线态氧(O)和过氧化物(HOO)中。这些物质可以氧化DNA造成多种损伤,包括碱基脱落、碱基氧化和单双链断裂等。8-羟基脱氧鸟苷(8-oxodGuo)是羟基自由基和单线态氧存在时最主要的DNA碱基氧化损伤产物。DNA复制时,8-oxodGuo可以引起碱基G:C→T:A的突变,产生基因或遗传毒性。8-oxodGuo作为一种有效的DNA氧化损伤生物标志物在很多领域都有研究和应用。比如在医疗诊断领域中,8-oxodGuo被用于评价个体癌变几率以及诊断与自由基相关的疾病;而在衰老机制或退行性疾病的研究中,8-oxodGuo也是主要的探讨目标。因此,构建可以快速、灵敏检测DNA氧化损伤的分析方法非常有必要。已经报道的检测DNA氧化损伤的方法很多,例如电化学传感(光电化学、电化学、电化学发光)因检测迅速、设备简单、且易于实现高通量等优点引起了很多科学研究者的关注。本论文主要包括两部分内容:第一部分综述了DNA损伤的产生及检测方法,电化学发光法分析的原理、特点及其应用。第二部分为研究内容。首先合成一种“光开关”分子作为电化学发光信号探针,在此基础上引入特异性的DNA糖基化酶放大DNA损伤,构建一种快速简便且高灵敏的电化学发光法检测DNA的氧化损伤。主要包括以下三个部分:1.[Ru(bpy)dppz](简称Ru-dppz)的合成及其与DNA的相互作用:首先利用1,10-邻菲罗啉5,6-二酮与邻苯二胺反应制备联吡啶体配合物二吡啶[3,2-a;2’,3’-c]吩嗪(Dppz),产物Dppz再与顺-双(2,2’-二吡啶基)二氯化钌(II)二水合物(Ru(bpy)Cl)反应制备二联吡啶二吡啶[3,2-a;2’,3’-c]吩嗪钌,Ru-dppz。接下来,分别用紫外-可见光谱法、核磁共振波谱法和质谱法对产物Ru-dppz进行结构表征。再对合成产物Ru-dppz与DNA相互作用的荧光性质进行了详细研究。结果显示,随着DNA的加入Ru-dppz荧光强度逐渐增加,说明Ru-dppz可以作为DNA分子“光开关”。通过荧光滴定实验得到Ru-dppz与DNA的结合常数为1.5×10L/mol,结合比为0.14,与文献报道基本一致。2.选用上步合成的Ru-dppz为信号探针,建立一种无标记的电化学发光法检测Fenton试剂造成的DNA氧化损伤。基于DNA糖基化酶Fpg(E.coli formamidopyrimidine)的双功能性质(识别和切除8-oxodGuo,水解磷酸二酯键形成切口),因此通过引入Fpg放大DNA的氧化损伤,实现DNA氧化损伤的高灵敏检测。首先,考虑到Ru-dppz的电化学和电化学发光行为,选择还原的氧化石墨烯(r-GO)纳米金(Au)复合纳米材料修饰的氧化铟锡(ITO)电极为基底电极,再将DNA组装到电极表面,结合Ru-dppz产生电化学发光信号,通过检测电化学发光信号的改变实现DNA的氧化损伤的检测。同时,我们还通过琼脂糖凝胶电泳实验、荧光实验以及选择性实验等证明了我们的实验设计与原理。在最优条件下,该方法可以检测到10 nM Fe/40 nM HO的Fenton试剂对DNA造成的损伤,检测灵敏度比类似的光电检测方法提高了1000倍。本方法为DNA氧化损伤的高灵敏检测提供了一种简便、灵敏的方案。3.为了进一步验证Fpg放大DNA氧化损伤的普遍适用性,我们研究了环境中另一种有害物质孟加拉玫瑰红对DNA造成的损伤。与Fenton反应造成DNA氧化损伤机理不同的是:孟加拉玫瑰红在光照作用下可以产生单线态氧。当DNA暴露于单线态氧时,由于单线态氧的能量较低,它能够损伤具有最低氧化电位的鸟嘌呤(G),且8-oxodGuo是其主要的损伤产物。采用DNA糖基化酶Fpg特异性识别并剪切8-oxodGuo的原理,检测微量孟加拉玫瑰红对DNA造成的氧化损伤,并研究了Fpg酶的特异性,结果显示该方法可以检测到0.1μg/mL的孟加拉玫瑰红造成的DNA损伤。

关键词：无标记电化学发光 8-羟基脱氧鸟苷 Fenton试剂 Fpg

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Ag,Cr与木瓜蛋白酶作用的研究

Ag,Cr与木瓜蛋白酶作用的研究

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中国化学会第十三届全国化学热力学和热分析学术会议

作者：卢雁张玮玮王公轲河南师范大学化学与环境科学学院河南师范大学化学与环境科学学院河南师范大学化学与环境科学学院

＜正＞近年来,国内外学者用各种物理和化学方法对蛋白质等大分子和多种无机离子的作用进行了研究。木瓜蛋白酶（papain）由212个氨基酸残基组成,每个酶分子包含一个半胱氨酸。2000年Anatoly Zhitkovich等人在一篇文章中曾报道过Cr6+可...

＜正＞近年来,国内外学者用各种物理和化学方法对蛋白质等大分子和多种无机离子的作用进行了研究。木瓜蛋白酶（papain）由212个氨基酸残基组成,每个酶分子包含一个半胱氨酸。2000年Anatoly Zhitkovich等人在一篇文章中曾报道过Cr6+可先将半胱氨酸的-SH氧化,然后再与其结合形成 S-Cr键,2004年Franco Cataldo证明了臭氧在碱性条件下可将正铁血红蛋白氧化成高铁血红蛋白。

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A New Anti-apoptosis Protein-HZF1

A New Anti-apoptosis Protein-HZF1

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2008年全国生物化学与分子生物学学术大会

作者： Xiao-bo Li Fang Wang Jun-wu Zhang (National Laboratory of Medical Molecular Biology,Institute of Basic Medical Science,Peking Union Medical College and Chinese Academy of Medical Sciences,Beijing 100005,People’s Republic of China.)

The novel zinc finger protein HZF1 was found to play a very important role in erythroid and megakaryo- cytic differentiation of K562 cells,here we reported its another new function.We employed the lentiviral vector to overexpress the HZF1 in the K562 cells and found that the HZF1 overexpressed cells could more resist the

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The Interaction between Hemoglobin and Peroxiredoxin 2 was Proved by Coimmunoprecipitation Coupled with Hemoglobin Release Test、SDS-PAGE and MS

The Interaction between Hemoglobin and Peroxiredoxin 2 was P...

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中国生物化学与分子生物学会第十一次会员代表大会暨201...

作者：安亮李晓晶谢彩霞魏春华杜晓红苏燕包头医学院

In this study,Co-immunoprecipitation was used to study the interactions between hemoglobin(Hb)and other proteins within erythrocytes.First,the fresh normal adult anticoagulatedwhole blood was washed with saline 4-5 times to prepare packed RBCs,whichwere further prepared into erythrocytes suspension and hemolysate respectively.Second,the erythrocytessuspension and hemolysate were electrophoresesed on the starchagarosemixed gel at the same time,and then the bands of HbA,HbA2 and HbA-HbA2 oferythrocyte sample and the corresponding bands of hemolysate sample were cut out fromthe gel.Third,proteins within the gel were enriched by freeze-thaw method,then the proteinsamples were co-immunoprecipitated with hemoglobinβantibody.The immunocomplexeswere then separated by 5–12%SDS-PAGE.7 kind of protein was emerged,and an2 kD protein band emerged in both erythrocytes HbA and hemolysate HbA.Finally,the2 kD band was cut out and analyzed by Q–TOF MS.The MS results showed that thisband was peroxiredoxin 2(Prx-2),an antioxidant enzyme,which uses cysteine residues todecompose peroxides.Prx-2 is the third most abundant protein in erythrocytes,and competeseffectively with catalase and glutathione peroxidase to scavenge low levels of hydrogenperoxide,including that derived from hemoglobin autoxidation.So we can concludethat the special interaction between Hb and peroxiredoxin 2 can help Prx2 defend theautoxidation of hemoglobin within erythrocytes,however,whether the interaction hassome relationship with clinical diseases still needs further research.

关键词： Hemoglobin Peroxiredoxin 2 Interaction Hemoglobin Release Test

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TRNA结构中Mg2+离子结合位点的核磁共振研究

TRNA结构中Mg2+离子结合位点的核磁共振研究

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第十二届全国波谱学学术会议

作者：颜贤忠薛红王子辉朱广国家生物医学分析中心香港科技大学生化系

tRNA 在遗传密码的解码过程中扮演着十分重要的作用,它负责将氨基酸转移到核糖体,并在那里装配成多肽链。tRNA 的构象在 tRNA 与氨酰 tRNA 合成酶的识别中是至关重要的。二价金属离子,特别是 Mg离子在维持 tRNA 的构象的稳定中有着特别...

tRNA 在遗传密码的解码过程中扮演着十分重要的作用,它负责将氨基酸转移到核糖体,并在那里装配成多肽链。tRNA 的构象在 tRNA 与氨酰 tRNA 合成酶的识别中是至关重要的。二价金属离子,特别是 Mg离子在维持 tRNA 的构象的稳定中有着特别重要的作用。本文对枯草杆菌 tRNA在不同 Mg浓度下构象的变

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Effect of fibril strength on prion propagation

Effect of fibril strength on prion propagation

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第二届全国“跨学科蛋白质研究”学术讨论会

作者：王一倩 Tuomas P.J.Knowles Mark E.Welland Christopher M.Dobson Sarah Perrett Institute of Biophysics Chinese Academy of Sciences Nanoscience Centre University of CambridgeUK Department of Chemistry University of CambridgeUK

Many proteins and peptides posses an ability to self-assemble into amyloid fibrils,which are highly organised nanostructures.However,prions,which are infectious and able to transmit information encoded in their fold to a host organism,represent only a small subset of amyloid structures.The mechanistic origin of this fundamental difference is not fully understood.Studies on evolutionary biology ofyeast prions have shown that[URE3] is not well conserved in the

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G蛋白功能调节因子RGS4与酸性磷脂的相互作用

G蛋白功能调节因子RGS4与酸性磷脂的相互作用

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中国生物化学与分子生物学会第八届会员代表大会暨全国学术...

作者：欧阳英石杨福愉中科院生物物理所生物大分子国家重点实验室

G蛋白信号通路普遍存在于真核生物细胞,将胞外信号跨膜传递至胞内.一般来说,此信号系统由G蛋白偶联的受体,G蛋白及其效应器组成.近年来人们发现一类称作RGS(Regulators of G-protein signaling)的蛋白家族成员能够显著促进G蛋白内源性GT...

G蛋白信号通路普遍存在于真核生物细胞,将胞外信号跨膜传递至胞内.一般来说,此信号系统由G蛋白偶联的受体,G蛋白及其效应器组成.近年来人们发现一类称作RGS(Regulators of G-protein signaling)的蛋白家族成员能够显著促进G蛋白内源性GTPase活性,从而下调G蛋白介导的一系列细胞应答活动.RGS

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基于RNA-Seq数据的没食子酸抑制黄曲霉毒素生物合成的机理研究

基于RNA-Seq数据的没食子酸抑制黄曲霉毒素生物合成的机理研究

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广东省遗传学会第九届代表大会暨学术研讨会

作者：赵西西贺竹梅中山大学生命科学大学院

黄曲霉毒素(Aflatoxin)主要由黄曲霉(Aspergillusflavus)和寄生曲霉(A.parasiticus)产生,其生物合成已经被证实与氧化压力存在密切关联。抗氧化剂没食子酸(Gallic acid,GA,3,4,5-三羟基苯甲酸)对黄曲霉毒素的合成具有明显的抑制作用,本...

黄曲霉毒素(Aflatoxin)主要由黄曲霉(Aspergillusflavus)和寄生曲霉(A.parasiticus)产生,其生物合成已经被证实与氧化压力存在密切关联。抗氧化剂没食子酸(Gallic acid,GA,3,4,5-三羟基苯甲酸)对黄曲霉毒素的合成具有明显的抑制作用,本文通过转录组测序(RNA-Seq)技术对抗氧化剂没食子酸抑制黄曲霉产生黄曲霉毒素的机理进行研究。我们的转录组数据表明,在没食子酸处理后有420个基因发生了显著性差异表达(q<0.05),其中包括一些氧化还原相关的基因以及初级代谢通路中的一些重要基因,如在戊糖磷酸途径中起重要调控作用的6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因,而戊糖磷酸途径是胞内NADPH的主要来源。在没食子酸处理后,这些初级代谢通路中上调表达的重要基因可能导致黄曲霉胞内的NADPH含量增加,同时促使乙酰辅酶A转向脂肪酸的合成而不是合成黄曲霉毒素。我们检测了黄曲霉胞内的NADPH含量,结果发现没食子酸处理导致黄曲霉胞内的NADPH含量要高于对照组,尤其是在处理72 h后;另外我们还发现在黄曲霉的培养液中分别加入0.5μmol/ml和1μmol/ml的NADPH均会抑制黄曲霉毒素的产生。在检测了没食子酸处理不同时间后谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶活性以及还原型谷胱甘肽的含量发现,谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶的活性以及谷胱甘肽含量在没食子酸处理48 h后均要高于对照组,这些酶以及还原型谷胱甘肽抵消了黄曲霉胞内积累的活性氧类(ROS),从而维持了黄曲霉胞内相对稳定的氧化还原状态。总的来说,抗氧化剂没食子酸改变了黄曲霉胞内初级代谢通路的活性,并维持了一种相对稳定的胞内氧化还原状态从而使黄曲霉更倾向于生长而不是产生黄曲霉毒素。

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动物microRNA相关核心蛋白的生物信息学分析

动物microRNA相关核心蛋白的生物信息学分析

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作者：刘修营东北农业大学

学位级别：硕士

非编码RNA是指不编码蛋白质的一类功能性RNA分子。其中microRNAs是一类小的、大约22个核苷酸长的非编码RNAs（non-coding RNAs）,这类小分子RNA在真核生物中参与许多重要的生物学过程,包括细胞生长、分化、增殖和凋亡等,也具有重要的时... 详细信息

非编码RNA是指不编码蛋白质的一类功能性RNA分子。其中microRNAs是一类小的、大约22个核苷酸长的非编码RNAs（non-coding RNAs）,这类小分子RNA在真核生物中参与许多重要的生物学过程,包括细胞生长、分化、增殖和凋亡等,也具有重要的时序调控功能,对胁迫的应答反应以及病毒防御功能等。在1993年,首先在秀丽隐杆线虫中发现了第一个microRNA,2001年microRNAs被正式命名。到现在,在动物、植物和病毒等许多生物中都发现了microRNAs,截止到2009年3月根据来自桑格（Sanger）研究中心的著名的microRNAs数据库miRBase中的数据,已经在103个物种中发现了9169个成熟的microRNAs。可见microRNAs的研究已经成为当前科学研究中一个新的领域和热点。在动物microRNAs的发生过程中需要许多蛋白或蛋白复合体的参与,其中研究较多的是Drosha,Dicer,Argonaute和Exportin 5这四个蛋白家族。为了系统地研究这四个蛋白家族,我们充分利用生物信息学的手段,在11个真核生物的基因组中,包括线虫,果蝇,斑马鱼,鸡,鸭嘴兽,牛,马,狗,大鼠,小鼠和人类,系统地分析了drosha,dicer,argonaute和exportin 5基因家族中的一些重要特征。本论文研究内容主要包括每个蛋白家族成员的数量,结构域的组成,选择性剪接现象,核定位信号,这些蛋白是否能与小RNA作用,编码这些蛋白的基因表达模式,这些蛋白之间及与其它蛋白的相互作用等。研究结果简要概括如下: 1.确定了每个蛋白家族在11个真核生物中的成员数量,并鉴别了一些新的成员。 2.构建了Drosha,Dicer,Argonaute和Exportin 5蛋白家族在不同物种间的系统发生树。 3.详细地阐明了drosha,dicer,argonaute和exportin 5基因编码的蛋白质的结构域,并发现同一基因家族的大部分蛋白质具有相同或相似的结构域。 4.发现了drosha,dicer和argonaute基因在所研究物种中的选择性剪切转录本。 5.鉴定了Argonaute蛋白家族中的核定位信号序列。 6.初步预测了11个物种中所有基因家族包含的microRNA的靶标序列。 7.探索了drosha,dicer和argonaute基因在人类34个不同组织中的表达模式。 8.构建了人类的Drosha,Dicer,Argonaute和Exportin 5蛋白之间相互作用的网络。通过以上研究和发现,提供了动物中的microRNAs发生过程中这四个核心蛋白的系统信息,为后续这些蛋白的功能研究指明了道路和方向。

关键词： microRNA Drosha Dicer Argonaute Exportin 5

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酶蛋白亚基片段折叠及相互作用的研究

酶蛋白亚基片段折叠及相互作用的研究

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第九届全国酶学学术讨论会暨邹承鲁诞辰85周年纪念会

作者：王金凤中国科学院生物物理研究所

金黄色葡萄球菌酶(SNase)是一种具有特殊性质的脱氧核糖核酸酶。它的作用底物是 DNA 和 RNA,需要 Ca离子的激活而水解核酸分子。自发现以来,该酶蛋白就被用作蛋白质结构功能关系以及蛋白质折叠研究的模型。在1971年,Anfinsen

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