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稳定转染短发夹状RNA后子宫颈癌细胞中人乳头状瘤病毒18型E6基因表达的变化

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中华妇产科杂志 2005年第10期40卷 693-696页

作者：陶光实张克强陈勇聂妹芳刘风英吴宜林刘毅智吴秀山中南大学湘雅二医院妇科长沙410011 湖南省计划生育研究所湖南师范大学生命科学院

目的探讨宫颈癌细胞株HeLa细胞稳定转染表达短发夹状RNA(shRNA)的质粒后,HeLa细胞中人乳头状瘤病毒18型E6基因(HPV18E6)表达的变化。方法实验组将本实验室前期构建的可遗传性表达HPV18E6shRNA的pE6-1shRNA质粒和含E6基因突变点的pE6-2sh... 详细信息

目的探讨宫颈癌细胞株HeLa细胞稳定转染表达短发夹状RNA(shRNA)的质粒后,HeLa细胞中人乳头状瘤病毒18型E6基因(HPV18E6)表达的变化。方法实验组将本实验室前期构建的可遗传性表达HPV18E6shRNA的pE6-1shRNA质粒和含E6基因突变点的pE6-2shRNA质粒分别转染HeLa细胞,对照组以空质粒pSUPER和不加质粒的脂质体分别转染HeLa细胞。稳定转染后,氨基糖苷抗生素(G418)筛选阳性细胞克隆,RT-PCR技术和免疫组化链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接(SP)法分别检测HeLa细胞中HPV18E6mRNA和蛋白表达的变化。结果稳定转染后,G418筛选,实验组HeLa细胞有新的阳性细胞克隆形成,而对照组HeLa细胞最终全部死亡。实验组转染pE6-1shRNA质粒的HeLa细胞中HPV18E6mRNA表达水平为0·76±0·28,明显低于对照组转染脂质体者(1·14±0·45)和转染pSUPER质粒者(1·12±0·23,P转染脂质体者弱。实验组转染pE6-2shRNA质粒的HeLa细胞中HPV18E6mRNA和蛋白表达水平分别与对照组比较,差异均无统计学意义(P>0·05)。结论稳定转染表达HPV18E6shRNA的质粒后,宫颈癌细胞中HPV18E6mRNA和蛋白表达明显受到抑制。

关键词： RNA干扰宫颈肿瘤转染癌基因蛋白质类,病毒性乳头状瘤病毒18型短发夹状RNA 子宫颈癌细胞稳定转染 E6基因基因表达

稳定转染MiR-499对P19CL6细胞向心肌细胞分化的影响

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中国生物化学与分子生物学报 2011年第4期27卷 316-322页

作者：李贤慧贾竹青崔庆华马康涛周春燕北京大学基础医学院生物化学与分子生物学系北京100191 北京大学基础医学院医学信息学系北京100191

小鼠miR-499基因包含在心肌重链肌球蛋白Myh7b基因的第19内含子中,并且在心肌细胞中特异表达,然而其在心肌细胞中表达的生物学功能和意义尚不清楚.利用可体外分化为心肌细胞的P19CL6细胞建立稳定表达miR-499的细胞株对研究miR-499的生... 详细信息

小鼠miR-499基因包含在心肌重链肌球蛋白Myh7b基因的第19内含子中,并且在心肌细胞中特异表达,然而其在心肌细胞中表达的生物学功能和意义尚不清楚.利用可体外分化为心肌细胞的P19CL6细胞建立稳定表达miR-499的细胞株对研究miR-499的生物学功能具有重要意义.根据小鼠miR-499基因序列,设计PCR引物并将扩增产物定向克隆到pcDNA3.1中构建为真核表达载体并转染小鼠P19CL6细胞,经G418筛选建立了稳定转染的P19CL6-miR-499细胞株.用TaqMan探针实时定量PCR检测表明,P19CL6-miR-499细胞可成功表达成熟的miR-499.经1%DMSO诱导分化,RT-PCR、real-time PCR和激光共聚焦显微镜免疫荧光分析,结果表明,稳定转染miR-499对细胞分化早期的分子标志Isl1和Tbx5的表达没有明显影响,但是对分化晚期的特异性分子心肌α-肌动蛋白(α-cardiac actin)和心肌肌钙蛋白(troponin I)的表达有明显抑制作用,这提示miR-499主要对心肌细胞分化晚期有影响.

关键词：小鼠miR-499 稳定转染真核表达心肌细胞分化 P19CL6细胞

人乳头状瘤病毒E6和E7蛋白过表达慢病毒载体构建及稳定转染喉上皮细胞系的建立

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中国耳鼻咽喉头颈外科 2022年第12期29卷 790-794页

作者：肖洋周思含牛子捷王军首都医科大学附属北京同仁医院咽喉科耳鼻咽喉头颈科学教育部重点实验室(首都医科大学)北京100730

目的分别构建过表达人乳头状瘤病毒(human papillomavirus,HPV)6型和11型的E6、E7癌基因的慢病毒载体,建立HPV6-E6-E7和HPV11-E6-E7基因过表达的SNU-1076喉上皮细胞系模型。方法分别合成表达HPV6-E6-E7和HPV11-E6-E7基因的片段,构建重... 详细信息

目的分别构建过表达人乳头状瘤病毒(human papillomavirus,HPV)6型和11型的E6、E7癌基因的慢病毒载体,建立HPV6-E6-E7和HPV11-E6-E7基因过表达的SNU-1076喉上皮细胞系模型。方法分别合成表达HPV6-E6-E7和HPV11-E6-E7基因的片段,构建重组慢病毒载体pHBLV-CMV-h-HPV6-E6-E7-3FLAG-ZsGreen-Puro和pHBLV-CMV-h-HPV11-E6-E7-3FLAG-ZsGreen-Puro。包装慢病毒后转染进入人喉上皮细胞系SNU-1076,经嘌呤霉素抗性筛选得到阳性克隆。采用实时定量PCR法分别检测HPV6-E6-E7和HPV11-E6-E7基因过表达的水平。结果通过测序验证质粒构建的成功。实时荧光定量PCR的结果显示,转染HPV6-E6-E7和HPV11-E6-E7基因的SNU-1076细胞系相较于转染对照空载体的细胞系出现了明显的扩增曲线。其中HPV6-E6-E7的过表达效果为41692倍,HPV11-E6-E7的过表达效果为124957倍。结论利用慢病毒法成功分别建立了过表达HPV6-E6-E7和HPV11-E6-E7的喉上皮SNU-1076细胞系。

关键词：人乳头状瘤病毒6 人乳头状瘤病毒11 癌基因慢病毒表达载体稳定转染喉上皮细胞系

稳定转染HSP72奶牛乳腺上皮细胞系建立与表达鉴定

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华北农学报 2018年第6期33卷 103-107页

作者：于文慧展西振丰艳妮曹荣峰姜忠玲李华涛田文儒青岛农业大学动物医学院山东青岛266109

为了构建HSP72慢病毒表达载体,建立稳定表达HSP72的牛乳腺上皮细胞系。以牛HSP72基因序列为模板,设计并合成引物,PCR扩增目的基因,连接到慢病毒表达质粒中,用包装获得的慢病毒感染牛乳腺上皮细胞,经一定浓度的嘌呤霉素筛选,Hochest3334... 详细信息

为了构建HSP72慢病毒表达载体,建立稳定表达HSP72的牛乳腺上皮细胞系。以牛HSP72基因序列为模板,设计并合成引物,PCR扩增目的基因,连接到慢病毒表达质粒中,用包装获得的慢病毒感染牛乳腺上皮细胞,经一定浓度的嘌呤霉素筛选,Hochest33342法对细胞核定位,倒置荧光显微镜下观察转染效率,用免疫组化和Western Blot方法验证感染细胞是否稳定表达HSP72。结果显示,携带HSP72基因的慢病毒滴度约为1. 0×109TU/m L;确定嘌呤霉素的最佳筛选浓度为2μg/m L;牛HSP72慢病毒感染细胞表达HSP72,感染的奶牛乳腺上皮细胞在倒置荧光显微镜下可看到绿色荧光,转染效率可达90%以上;免疫组化结果表明,正常细胞和空载体感染细胞,HSP72呈现低表达,转染携带HSP72目的基因载体细胞,HSP72高表达,呈现颜色较深的棕色; Western Blot方法检测证实与正常转染细胞相比,慢病毒空载体转染的奶牛乳腺上皮细胞HSP72表达稍有降低,但无统计学差异,而携带HSP72基因的慢病毒载体转染的细胞HSP72呈现高表达,且差异极显著(P 转染的奶牛乳腺上皮细胞相比,携带HSP72基因的慢病毒载体转染的细胞HSP72呈现高表达,且差异极显著(P 稳定表达HSP72的牛乳腺上皮细胞系,可为研究奶牛乳腺炎分子调控机制以及抗性分子药物筛选提供新的理论依据和工作基础。

关键词： HSP72 稳定转染慢病毒载体奶牛乳腺上皮细胞

pEGFP-NTCP稳定转染HEK293细胞系的建立及鉴定

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中国药理学通报 2016年第12期32卷 1767-1772页

作者：陈雅李静张文政罗敏傅晓钟刘亭民族药与中药开发应用教育部工程研究中心贵州贵阳550004 贵州医科大学药学院贵州贵阳550004 国家苗药工程技术研究中心贵州贵阳550004 贵州省药物制剂重点实验室贵州贵阳550004

目的高效快速地建立稳定高表达钠离子-牛磺胆酸共转运多肽(sodium taurocholate cotransporting polypeptide,NTCP)的HEK293细胞系。方法构建可表达EGFP-NTCP融合蛋白的p EGFP-NTCP重组质粒,并利用Fu GENE 6转染试剂将重组质粒转染至HEK... 详细信息

目的高效快速地建立稳定高表达钠离子-牛磺胆酸共转运多肽(sodium taurocholate cotransporting polypeptide,NTCP)的HEK293细胞系。方法构建可表达EGFP-NTCP融合蛋白的p EGFP-NTCP重组质粒,并利用Fu GENE 6转染试剂将重组质粒转染至HEK293细胞中。用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达情况,挑选转染细胞进行14 d G418筛选和单克隆培养,以获得稳定转染细胞株。用RT-PCR法、qRT-PCR法和Western blot技术检测稳定转染细胞及正常细胞中NTCP mRNA和蛋白的表达情况,并进一步用超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)考察稳定转染细胞的牛磺胆酸摄取能力。结果使用本文优化的方法,细胞转染率可达90%。RT-PCR、qRT-PCR、Western blot和牛磺酸摄取实验结果显示:相对于正常组,在荧光显微镜下呈绿色荧光的转染细胞;其NTCP表达均显阳性(P稳定转染细胞的牛磺胆酸摄取能力明显升高(P稳定高表达NTCP的HEK293细胞系,为胆酸衍生物摄取机制研究奠定了基础。

关键词： NTCP EGFP 稳定转染牛磺胆酸 HEK293细胞高效快速

人hCGβ真核表达载体的构建及稳定转染B16细胞系的建立

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细胞与分子免疫学杂志 2010年第7期26卷 623-626页

作者：张亮王宇江乐阎瑾琦王越胡明明于继云军事医学科学院基础医学研究所

目的：构建人hCGβ真核表达载体，稳定转染入小鼠黑色素瘤B16细胞，建立稳定表达人hCGβ的小鼠黑色素瘤细胞系。方法：采用PCR方法扩增出人hCGβ全长基因的cDNA编码区序列，利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pIRES—neo中，并... 详细信息

目的：构建人hCGβ真核表达载体，稳定转染入小鼠黑色素瘤B16细胞，建立稳定表达人hCGβ的小鼠黑色素瘤细胞系。方法：采用PCR方法扩增出人hCGβ全长基因的cDNA编码区序列，利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pIRES—neo中，并加入酶切位点和6×His标签，得到重组表达质粒pIRES—neo—hCGβ-（His）6。利用阳离子脂质体介导法将其稳定转染入小鼠黑色素瘤B16细胞，经G418加压筛选出阳性克隆。RT—PCR、Western blot及免疫荧光检测人hCGβ在B16细胞中的表达。结果：经限制性内切酶鉴定及序列分析，pIRES—neo—hCGβ一（His）6重组体构建正确，最终建立的表达人hCGβ基因的B16细胞系阳性率高于90％。结论：成功构建了真核表达载体plRES—neo—hCGβ-（His）6，建立的稳定转染人hCGβ小鼠黑色素瘤细胞系能够高效表达hCGβ基因。该稳定转染细胞系的建立为进一步研究人hCGβ抗肿瘤基因疫苗的功能提供了良好的实验基础，为hCGβ在肿瘤免疫治疗中的应用奠定了研究基础。

关键词： hCGβ 稳定转染小鼠黑色素瘤细胞肿瘤免疫治疗

人EGFL7真核表达载体的构建及稳定转染***926细胞系的建立

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现代医学与健康研究电子杂志 2022年第23期6卷 1-4页

作者：丁悦黄为民唐丽君南方医科大学南方医院新生儿科广东广州510515

目的建构对人类表皮生长因子样结构域7(EGFL7)基因真核表达载体以及稳定性转染***926细胞系的科学评价体系。方法采用实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)方法获得EGFL7的开放阅读框(ORF),借助双酶切方式,使得EGFL7能够被克隆至真核表达载... 详细信息

目的建构对人类表皮生长因子样结构域7(EGFL7)基因真核表达载体以及稳定性转染***926细胞系的科学评价体系。方法采用实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)方法获得EGFL7的开放阅读框(ORF),借助双酶切方式,使得EGFL7能够被克隆至真核表达载体(pEGFP-N1)中并获取到已经重组好的质粒pEGFP-N1-EGFL7。在进一步接受测序和鉴定处理后,借助电转仪对***926细胞进行转染,然后通过G418筛查进而建构起稳定性转染***926细胞系。使用实时荧光定量PCR和免疫印迹法检测EGFL7基因及蛋白在***926细胞系中的表达。结果转染EGFL7的***926细胞的EGFL7基因和蛋白水平均明显高于对照质粒转染组和空白对照组(P<0.05)。结论成功建构人EGFL7真核表达载体并鉴定了EGFL7在***926细胞系中的过表达,为探讨EGFL7对早产儿支气管肺发育不良的影响奠定基础。

关键词： EGFL7 真核表达载体稳定转染 EA.hy926细胞系

MiR-122稳定转染细胞系的建立及其脂代谢特征

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第二军医大学学报 2009年第7期30卷 825-829页

作者：章亚南王芳杨富殷一旋张玲孙树汉第二军医大学基础部医学遗传学教研室上海200433

目的:利用稳定表达人miR-122前体的表达载体,转染低表达miR-122的人肝癌细胞系HepG2细胞,获得过量表达miR-122的稳定转染细胞系,探讨miR-122对肝脏细胞脂代谢的影响及其机制。方法:对已构建完成的表达质粒pEZX-hsa-mir-122和对照质粒pEZ... 详细信息

目的:利用稳定表达人miR-122前体的表达载体,转染低表达miR-122的人肝癌细胞系HepG2细胞,获得过量表达miR-122的稳定转染细胞系,探讨miR-122对肝脏细胞脂代谢的影响及其机制。方法:对已构建完成的表达质粒pEZX-hsa-mir-122和对照质粒pEZX-mir-control进行酶切鉴定,对酶切正确的克隆进行DNA测序,测序正确的克隆应用脂质体试剂转染,绿色荧光蛋白表达监测转染效率,应用嘌呤霉素筛选稳定转染细胞系,实时定量PCR在RNA水平鉴定miR-122的表达,蛋白质印迹法从靶分子水平验证miR-122的抑制功能,尼罗红染色观察细胞内脂质。结果:pEZX-hsa-mir-122质粒成功转染HepG2细胞,质粒携带的miR-122前体序列整合到细胞基因组中,获得过量表达miR-122的HepG2细胞株,细胞内成熟体miR-122可抑制靶基因的翻译,细胞内脂质明显增加。结论:人miR-122前体序列可整合在HepG2细胞基因组中,过量表达miR-122的HepG2细胞出现脂质代谢异常。

关键词：人miR-122 稳定转染脂代谢嘌呤霉素 HepG2细胞

丙肝病毒NS5B-EGFP融合蛋白真核表达载体的构建及稳定转染HepG_2细胞系的建立

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中华实验和临床病毒学杂志 2005年第1期19卷 49-51页

作者：雷迎峰薛小平尹文吕欣杨敬第四军医大学微生物学教研室西安710032

目的　构建可表达丙型肝炎病毒 (HCV)NS5B EGFP融合蛋白的真核表达载体 ;获得重组质粒稳定转染的HepG2 细胞系。方法　利用PCR技术从HCV基因组中扩增出ns5b基因片段 ,XhoⅠ KpnⅠ双酶切后连接到经同样酶切的pEGFP N3真核表达载体 ,转化... 详细信息

目的　构建可表达丙型肝炎病毒 (HCV)NS5B EGFP融合蛋白的真核表达载体 ;获得重组质粒稳定转染的HepG2 细胞系。方法　利用PCR技术从HCV基因组中扩增出ns5b基因片段 ,XhoⅠ KpnⅠ双酶切后连接到经同样酶切的pEGFP N3真核表达载体 ,转化TG1菌株感受态细胞 ,获得阳性重组质粒pEGFPN3 ns5b。将阳性克隆用脂质体法转染HepG2 细胞 ,经持续G4 18压力选择和有限稀释法克隆化获得稳定转染的细胞系。结果　成功构建了真核表达载体pEGFPN3 ns5b ;建立了其重组质粒稳定转染的HepG2 细胞系。结论　重组质粒稳定转染的HepG2 细胞系可表达NS5B EGFP融合蛋白 ;该HepG2

关键词： HepG2细胞稳定转染真核表达载体 EGFP 重组质粒融合蛋白丙肝病毒阳性克隆 b基因感受态细胞