检索结果-南通市图书馆

作者：孙捷吉林大学

学位级别：硕士

蛋白构象决定疫苗的免疫原性。在对病毒进行灭活处理过程中,需要加入不同的灭活剂,灭活剂会与蛋白相互作用,从而对病毒构象产生影响,进而影响疫苗的免疫原性。甲醛(Formaldehyde,FA)是最常用的灭活剂,主要作用于病毒表面蛋白,导致蛋白... 详细信息

蛋白构象决定疫苗的免疫原性。在对病毒进行灭活处理过程中,需要加入不同的灭活剂,灭活剂会与蛋白相互作用,从而对病毒构象产生影响,进而影响疫苗的免疫原性。甲醛(Formaldehyde,FA)是最常用的灭活剂,主要作用于病毒表面蛋白,导致蛋白发生交联,影响抗原表位的呈现;而过氧化氢(HO)可以利用其羟基自由基攻击核苷中的碳双键或主干氢原子造成病毒基因组损伤从而发挥灭活作用,可能对病毒蛋白及结构影响小。由于FA和HO对病毒的作用方式不同,制备的灭活疫苗的免疫原性也会有所区别。流感病毒呈季节性流行且频繁突变,每年全球范围内大约有29～64万人因流感感染而死亡。预防流感的有效方法是疫苗接种,但市售季节性流感疫苗不能提供持久以及广谱的保护,所以研发高质量的流感病毒疫苗迫在眉睫。当前,季节性流感主要由甲型流感病毒(Influenza A Virus,IAV)引起,以H3N2和H1N1亚型流感病毒为主。本研究以H3N2为对象,进行了HO和FA灭活条件的探索。在鸡胚中进行疫苗灭活验证发现,不同灭活剂的作用时间不同,1%HO完全灭活H3N2需要4小时,而0.02%FA需要5天。本研究用上述灭活条件制备了HO灭活-H3N2(Hi-H3N2)和FA灭活-H3N2(Fi-H3N2)疫苗并进行体外表征。首先本研究通过检测HO残留量评价了Hi-H3N2的安全性,Hi-H3N2中HO含量为27μM。其次,为了评价HO和FA灭活对H3N2主要保护性抗原蛋白血凝素(Hemagglutinin,HA)的影响,比较了灭活前H3N2、Hi-H3N2和Fi-H3N2的血凝效价和蛋白含量。Hi-H3N2的血凝效价和蛋白含量高于Fi-H3N2,说明HO灭活对H3N2 HA的影响较小,有利于工艺的开发。最后,为了研究HO和FA灭活对HA表位的影响,对一定HA蛋白含量的灭活前H3N2、Hi-H3N2和Fi-H3N2进行体外抗原性检测,结果发现,Hi-H3N2的OD值显著高于Fi-H3N2,使用HO灭活较FA在保持抗原完整性上更具有优势。为了探究Hi-H3N2和Fi-H3N2灭活疫苗的免疫原性影响,本研究将Hi-H3N2和Fi-H3N2分别辅以MF59佐剂对BALB/c小鼠进行两次免疫,从Ig G抗体和血凝抑制(Hemagglutinin Inhibition,HI)抗体水平、IFN-γT细胞数目3个方面进行评价。在加强免疫后Hi-H3N2疫苗接种所产生的HI抗体是Fi-H3N2疫苗的1.6倍,Hi-H3N2疫苗组小鼠单个淋巴细胞刺激后产生的IFN-γT细胞数目显著高于Fi-H3N2组。结果表明,Hi-H3N2疫苗接种不仅显著增强机体中和抗体反应,而且能够促进细胞免疫反应的产生。接着,在加强免疫后2周进行鼻内感染10 EID同亚型病毒株H3N2,通过检测体重变化、肺部病毒载量和病理切片来进行保护性评价。攻毒保护性试验结果显示,相比较Fi-H3N2,Hi-H3N2能显著抑制H3N2在小鼠肺部组织的复制。综上,本论文以H3N2为例,制备了FA和HO两种灭活剂的流感灭活疫苗,通过抗原性、免疫原性和保护性评价比较,评估了FA和HO灭活在H3N2流感疫苗制备中对病毒的影响。本研究为流感灭活疫苗的进一步研究奠定了良好基础,同时也对其他病毒的灭活处理及灭活剂的相关评价具有一定的指导意义。

关键词： A(H3N2)亚型流感病毒甲醛过氧化氢灭活疫苗抗原性免疫原性保护性

去泛素化酶USP3通过稳定A3G抑制HIV-1复制的机制研究

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去泛素化酶USP3通过稳定A3G抑制HIV-1复制的机制研究

作者：赵思敏吉林大学

学位级别：硕士

逆转录RNA病毒HIV-1,是获得性免疫缺陷综合征——艾滋病的主要病原体,HIV-1感染的肆虐严重威胁着人类生命健康。HIV-1可以利用自身的辅助蛋白劫持宿主细胞内的泛素化系统靶向宿主细胞内的抗病毒因子,使其被泛素化蛋白酶体途径降解,达到... 详细信息

逆转录RNA病毒HIV-1,是获得性免疫缺陷综合征——艾滋病的主要病原体,HIV-1感染的肆虐严重威胁着人类生命健康。HIV-1可以利用自身的辅助蛋白劫持宿主细胞内的泛素化系统靶向宿主细胞内的抗病毒因子,使其被泛素化蛋白酶体途径降解,达到逃避宿主免疫杀伤的目的。天然免疫蛋白APOBEC3G(A3G)具有广谱抗病毒作用,为了拮抗A3G的抗病毒活性,HIV-1的病毒辅助蛋白Vif在分子伴侣CBF-β的作用下招募Cul5-Elo B-Elo C最终形成E3泛素连接酶复合物,将底物A3G泛素化,并使其被蛋白酶体途径降解,进而帮助病毒实现免疫逃脱。蛋白质的泛素化作为一种高度可逆的过程,可以与去泛素化在体内形成动态平衡,是常见的蛋白质翻译后修饰的一种。被认为是病毒感染,肿瘤、神经退行性疾病等许多重大疾病的重要药物靶标。去泛素化酶(DUB)可切割连接的泛素分子之间或泛素与修饰蛋白之间的肽或异肽键,逆转蛋白命运。作为最大的DUB亚家族,USPs主要通过其去泛素酶活性在抗病毒固有免疫反应和病毒触发的凋亡等方面调节病毒感染,USPs在HIV-1感染中的重要作用有待阐明。本研究中,我们探讨了去泛素化酶USP3通过稳定A3G对HIV-1复制的抑制作用及分子机制,主要包括以下内容:***3以胞苷脱氨酶A3G依赖的方式特异性地抑制HIV-1复制。我们的研究发现在有内源A3G的H9细胞系中,USP3可以显著抑制HIV的复制,而在无内源A3G的Jurkat细胞中则病毒复制无明显变化。据此我们推测USP3以A3G依赖的方式特异性地抑制HIV-1复制;在不含有内源性A3G的HEK293T细胞中共转染野生型HIV-1、USP3和A3G,增加USP3表达可以上调A3G的蛋白水平,增强了A3G抗HIV的能力。***3通过拮抗Vif诱导A3G泛素化来稳定A3G。为了探究USP3对于A3G的调节是否与Vif相关,在HEK293T中共转染A3G、Vif及USP3后,Vif诱导的A3G降解明显得到恢复。共转染Vif缺陷的HIV-1以及USP3、A3G和Vif发现USP3过表达上调了A3G蛋白水平,HIV-1病毒量低于对照组。Co-IP结果表明,USP3通过特异性的移除A3G的多聚泛素化来抑制Vif诱导的A3G泛素化及降解,而不是通过破坏Vif与Cul5、Elo B/C和CBF-β之间的相互作用。***3通过酶活依赖和非酶活依赖途径实现对A3G的稳定。为了探究USP3抑制Vif诱导A3G降解是否依赖酶活,本实验构建了锌指结构域ZNF及含有酶活中心的UCH截短体。共转染及IP结果表明:USP3 WT和UCH都可以通过特异性去泛素化A3G来稳定其表达。同时,不具有酶活性中心的ZNF区域也可以稳定A3G的表达,由此猜测USP3促进A3G表达是否有其他非酶活依赖的途径。在表达内源性A3G的Hep G2细胞中,我们还观察到USP3截短体在蛋白水平和m RNA水平都显著增加了A3G的表达。即USP3直接通过稳定A3G m RNA水平来增加A3G的表达。进一步结果表明,USP3特异性地促进了A3家族成员在蛋白质和m RNA水平的表达,而不影响同为宿主限制性因子的SAMHD1和HLTF的蛋白及m RNA水平,即USP3特异性地促进A3蛋白家族的表达。体内IP结果也表明USP3可以与A3G m RNA结合从而稳定A3G的表达。这些结果表明,USP3可能通过调节或剪接A3G m RNA而影响A3G的表达。***3作为抗病毒因子具有广谱性。因为A3G具有广谱抗病毒作用,USP3通过增加A3G的表达能够抑制肠道病毒EV71及CA16的复制。且HIV-1感染者CD4+T细胞中USP3的表达水平与HIV-1感染的进程有关。综上:我们证明了去泛素化酶USP3通过依赖酶活和非依赖的方式稳定A3G表达抑制HIV-1复制,揭示抗病毒因子USP3在宿主与病毒相互作用中的新功能,USP3-A3G去泛素化体系有望成为抗病毒治疗的新靶点。

关键词： USP3 APOBEC3G HIV-1Vif 去泛素化

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肠道病毒68型病毒样颗粒免疫原性初步研究

肠道病毒68型病毒样颗粒免疫原性初步研究

作者：付莹吉林大学

学位级别：硕士

肠道病毒68型(Enterovirus 68,EV-D68)是小RNA病毒科(Picromaviradae),肠道病毒属D组的成员,于1962年首次被分离鉴定。自2005年以来在全球多个地发生EV-D68相关疾病的爆发和流行。儿童感染EVD68可引起咽炎和支气管炎等多种呼吸道疾病,... 详细信息

肠道病毒68型(Enterovirus 68,EV-D68)是小RNA病毒科(Picromaviradae),肠道病毒属D组的成员,于1962年首次被分离鉴定。自2005年以来在全球多个地发生EV-D68相关疾病的爆发和流行。儿童感染EVD68可引起咽炎和支气管炎等多种呼吸道疾病,严重时可导致肺炎和呼吸衰竭。EV-D68严重危害公众健康,目前仍然没有有效的疫苗可以用于EV-D68引起的相关疾病的防治。疫苗是控制和预防传染性疾病最有效的措施。病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs)是由病毒的一种结构蛋白或多种结构蛋白组成而不含有病毒基因组,它是一种新型的疫苗形式。VLPs经过自组装后形成的模拟天然病毒的结构,具有病毒类似的免疫原性而能有效激活机体的天然免疫和获得性免疫应答;但因其不含有病毒基因组,在体内不会复制增殖,VLPs比活疫苗相对更安全。自重组乙肝疫苗上市以来,VLPs引起人们的广泛关注,目前已成为疫苗研发领域的热点。昆虫杆状病毒表达系统是目前常用的表达、制备VLPs的系统。本论文基于昆虫杆状病毒表达系统(Bac-to-Bac)制备EV-D68-VLPs。通过对EV-D68-VLPs收获时间及感染复数(MOI)等参数的优化,确定MOI为0.2,感染后72 h收获EV-D68-VLPs表达量相对较高。应用Western Blotting和透射电镜(TEM)对由蔗糖密度梯度离心(30%、40%、50%)方法纯化制备的VLPs进行了鉴定,结果显示成功制备了EV-D68-VLPs。应用BALB/c小鼠模型,评价了EV-D68-VLPs的免疫原性。三针免疫策略,EV-D68-VLPs能诱导小鼠产生较高的抗EV-D68中和抗体。在提高免疫剂量后,中和抗体滴度随之提高,呈良好的剂量效应关系。此外,在相同剂量组,添加氢氧化铝佐剂有助于提高中和抗体效价。综上所述,本论文利用昆虫杆状表达系统成功制备了具有免疫原性的EV-D68-VLPs。这为以后EV-D68的疫苗研发提供了技术方法和依据。

关键词：肠道病毒68型 VLPs Bac-to-Bac系统免疫原性中和抗体

2型单纯疱疹病毒gD亚单位相关疫苗佐剂筛选及免疫学评价

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2型单纯疱疹病毒gD亚单位相关疫苗佐剂筛选及免疫学评价

作者：陈志军吉林大学

学位级别：硕士

2型单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus type 2,HSV-2)是一种在全球范围内广泛传播的生殖器疱疹病毒,具有嗜神经性、于感觉神经元内终身潜伏并时常发作的特点,是导致生殖器疱疹产生及复发的主要因素。HSV-2主要通过性传播,其阳性患者感... 详细信息

2型单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus type 2,HSV-2)是一种在全球范围内广泛传播的生殖器疱疹病毒,具有嗜神经性、于感觉神经元内终身潜伏并时常发作的特点,是导致生殖器疱疹产生及复发的主要因素。HSV-2主要通过性传播,其阳性患者感染HIV-1的风险将增加2-3倍。据统计,现今全球感染者超过5亿,每年约有2360万例新增感染患者。目前针对有明显症状的HSV-2感染者,临床上大多选择口服抗病毒药物如阿昔洛韦等进行抗病毒治疗,但这种方法只能轻微缓解临床症状,并不能将病毒彻底清除,无法阻止复发性感染的发生。而一些无症状感染者,则因病毒无声脱落的存在,加大了病毒传播的可能性。基于HSV-2感染的普遍性及现有临床干预手段的局限性,亟需开发一种有效的HSV-2疫苗。关于HSV-2疫苗的研究可追溯到上世纪30年代,通常将其分为预防性和治疗性两种。近百年来,研究人员进行了不懈探究,但目前仍无被批准上市的有效的HSV-2疫苗。随着对于单纯疱疹病毒认识的不断深入及相应疫苗研发失败经验的不断积累,研究人员发现,有效地HSV-2疫苗除需诱导较强的抗体反应外,还需激发CD4及CD8T细胞反应;加强固有免疫及黏膜免疫应答以在病毒入侵的局部快速响应,有效清除外来病原体及被感染细胞。而佐剂除具有增强亚单位抗原免疫反应的能力外还可指导不同类型的免疫反应以抵抗HSV-2感染,因此在疫苗的研发过程中,其选择尤为重要。MF59与多种可溶性抗原具有良好的相容性;葛兰素史克(Glaxo Smith Kline,GSK)公司研发的新型系列人用疫苗佐剂AS(adjuvant System,AS),已在多种市售疫苗或临床实验中证明其有效性;BLP作为多种抗黏膜病原体疫苗的黏膜佐剂或抗原载体,具有显著的免疫刺激作用。因此,在本论文中,选择传统的Al(OH)和MF59佐剂作为对照,将GSK佐剂系统中的AS02,AS03首次应用于HSV-2预防性亚单位疫苗的研究中,以比较四种系统性佐剂辅助抗原的免疫增强效果及免疫反应偏向性;探究新型黏膜佐剂BLP在鼻内免疫的HSV-2重组亚单位疫苗中的免疫刺激作用并侧重从诱发黏膜免疫反应的角度进行分析。以上佐剂均与可介导病毒与宿主细胞膜融合并具有多种T细胞表位和中和抗体表位的包膜糖蛋白D的截短型gD2(1-285aa)(或BLP与重组融合蛋白gD2-PA非特异性结合)混合,分别制备预防性亚单位疫苗和用于黏膜免疫的重组亚单位疫苗,并在小鼠模型中进行评价。全文共分为以下两部分:(1)构建pSecTag2A-gD2质粒并在HEK293T真核表达系统中表达并纯化获得大量gD2及gD2-PA两种目的蛋白;(2)制备上述五种免疫原分别免疫小鼠三次,并对其进行免疫学评价。结论:(1)四种系统性佐剂及新型黏膜佐剂BLP均具有良好的免疫原性,相应疫苗对于致死剂量HSV-2攻毒表现出不同程度的保护性;(2)系统佐剂疫苗免疫组:AS02能诱导产生最高水平的抗体反应,在Th偏向性实验中,Al(OH)、MF59以及AS03均具有Th2型体液免疫偏向性,而AS02则略偏向于诱导相对平衡的Th1/Th2反应,既能诱导体液免疫反应又能介导细胞免疫应答,能够完全清除病毒并对攻毒后小鼠具有100%的保护性;(3)黏膜免疫组:重组融合蛋白gD2-PA-BLP免疫组可仅通过诱导高水平的黏膜特异性IgA抗体反应而对生殖道病毒进行有效清除,是一种有潜力的用于黏膜免疫的重组亚单位疫苗。

关键词： 2型单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus type2,HSV-2) 亚单位疫苗系统性佐剂黏膜免疫细菌样颗粒(Bacterium-like particle,BLP)

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不同狂犬疫苗免疫后血清交叉保护作用研究

不同狂犬疫苗免疫后血清交叉保护作用研究

作者：张姝吉林大学

学位级别：硕士

目的：狂犬病是一种由狂犬病毒引起的致死性疾病，注射狂犬病疫苗是预防发病的重要手段。我国存在多种狂犬病毒流行株，这就要求疫苗能刺激机体产生对不同流行株具有交叉保护的广谱中和抗体。目前对我国市售的狂犬病疫苗的广谱保护性的... 详细信息

目的：狂犬病是一种由狂犬病毒引起的致死性疾病，注射狂犬病疫苗是预防发病的重要手段。我国存在多种狂犬病毒流行株，这就要求疫苗能刺激机体产生对不同流行株具有交叉保护的广谱中和抗体。目前对我国市售的狂犬病疫苗的广谱保护性的研究较少，因此本研究将进行动物实验检测这些狂犬疫苗对不同株病毒的保护性。此外，研究表明多种包膜病毒（如HIV-1，流感病毒，丙型肝炎病毒）膜蛋白的糖基化会使病毒逃避抗体的中和作用，而狂犬病毒包膜蛋白G蛋白这方面的研究比较少，本研究也将探索狂犬病毒G蛋白的糖基化对病毒感染能力和抗体中和作用的影响。方法：本研究使用假病毒系统对我国狂犬疫苗的广谱保护性进行验证。选用四种不同株病毒制备的狂犬病疫苗对balb/c小鼠进行分组免疫并收获血清。制备几种具有HIV-1核衣壳和狂犬病毒G蛋白的假病毒，该假病毒携带荧光素酶报告基因，具有单轮感染能力，感染细胞可以表达荧光素酶。将假病毒与免疫血清共孵育后感染BHK-21细胞，根据荧光素酶表达量确定免疫血清对不同株狂犬假病毒中和能力。另一方面，通过定点突变的方法增加或减少病毒G蛋白上的糖基化位点，检测突变株病毒的感染能力以及免疫血清对病毒的中和能力。结果：成功包装了能够感染BHK-21细胞并表达荧光素酶的CVS-11株、CTN株、aG株假病毒，免疫了不同狂犬疫苗的小鼠体内产生的抗体对上述假病毒均具有中和能力。病毒G蛋白204位和247位氨基酸的糖基化对病毒的感染能力产生一定影响，单独增加204位糖基化使病毒感染能力增强，单独去除247位糖基化位点使病毒感染能力降低，同时进行上述两种变化则病毒感染能力下降。但改变上述糖基化位点，免疫血清对病毒的中和能力没有改变。结论：本研究证明了我国狂犬病疫苗免疫后血清对不同流行株具有中和能力，说明市售的四种狂犬疫苗能产生广谱中和抗体。狂犬病毒G蛋白204位和247位糖基化位点对病毒的感染能力具有一定的影响，但不能使病毒逃避抗体的中和作用，说明尽管不同毒株的抗原性和糖基化有所差异，但不影响中和抗体对这些病毒的中和能力。本研究中采用的假病毒检测方法还可以对其他狂犬病疫苗的适用性和质量进行评价。

关键词：狂犬病毒疫苗交叉保护 G蛋白糖基化假病毒

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基于GLuc新型抗体检测技术的建立

基于GLuc新型抗体检测技术的建立

作者：马同辉吉林大学

学位级别：硕士

Gaussia荧光素酶(GLuc)是分离于海洋桡脚类动物(Gaussia princeps)的新型荧光素酶。该荧光素酶能够催化腔肠素发出475nm的荧光。是目前己知的几种荧光素酶(Firefly Luciferase、Renilla Luciferase、Copepod Luciferase等)中,分子量最小的荧光素酶(约19.9KD),但却是目前发光强度最强的荧光素酶,因而在检测中具有广阔的应用前景。 GBV-C病毒(庚型肝炎病毒)是1995年从非甲-戊型肝炎病人体内,获得的新型病毒。起初,由于该病毒从未知病因的肝炎病人体内获得,因而认为其导致肝炎。但经过多年大量的流行病调查,发现该病毒在健康人中也有很大比例的分布,美国约2%-5%的健康人感染该病毒,但没有肝炎症状。最近,更是有大量实验证实该病毒复制的起始位置并不在肝脏,并通过体外实验证实该病毒可以在PBMC细胞中复制。但到目前为止,该病毒的具体复制起点仍然不清楚。且尚没有发现任何确切的疾病与该病毒相关,但大量的实验证实,GBV-C病毒具有-定的拮抗HIV病毒的作用,更是有实验证实,GBV-C的E2蛋白具有多种抗HIV的机制,NS3蛋白和NS5a蛋白以及抗GBV-C E2蛋白的抗体也有抗HIV的作用。 HIV病毒自1981年在美国发现以来,己造成全球超过1200万人死亡,并导致至少3000万人被感染,严重威胁着人类的健康。然而到目前为止,尚无针对艾滋病的有效治愈方法,被寄予厚望的艾滋病疫苗,却由于HIV病毒本身独具的特点,而屡遭挫折。目前,针对上述两种病毒的检测主要依靠ELISA方法进行。对于GBV-C的检测,主要以检测抗GBV-C E2蛋白的抗体作为GBV-C阳性的重要依据,而GBV-C E2蛋白是GBV-C病毒的一种包膜蛋白,具有三个糖基化位点,有实验证明血清中的E2抗体不识别原核表达的E2蛋白,据推测血清中的E2抗体只识别E2的空间表位。而原核表达的E2蛋白,未进行正确的修饰,不具有正确的空间构象。而目前常用的检测抗E2抗体的抗原E2蛋白均是由真核表达的,虽然具有了正确的构象,能够进行检测。但真核表达系统蛋白的纯化需要耗费大量的时间和成本,不利于检测的开展。本实验采用GLuc分别与GBV-C的E2蛋白以及HIV的P24蛋白融合表达,构建酶标E2蛋白和酶标P24蛋白。由于GLuc能够经高尔基体分泌表达,这样就可以直接对GBV-C E2蛋白进行糖基化,而P24蛋白无糖基化位点,不会被糖基化。而且,酶标蛋白分泌到上清中,可以吸取细胞培养上清直接应用于检测,省去了纯化等复杂的步骤。本论文利用能够吸附IgG抗体的sProteinA免疫磁珠对血清中的抗体进行吸附,然后加入上述酶标蛋白对血清中的抗体进行检测,通过实验成功检测到了GBV-C阳性血清和HIV阳性血清,且阳性血清和阴性血清的荧光值有很大差异。通过上述方法建立了基于GLuc的抗GBV-C E2抗体和抗HIV P24抗体的检测方法,该方法相对于目前常规的ELISA,省去了蛋白纯化等复杂步骤,有利于检测方法的迅速建立,对于建立突发传染性疾病的检测方法具有一定的借鉴意义

关键词：庚型肝炎病毒人类免疫缺陷病毒 Gaussia荧光素酶 E2蛋白 P24蛋白

HPV6 L1蛋白原核表达条件优化及三色荧光假病毒中和抗体检测方法建立

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HPV6 L1蛋白原核表达条件优化及三色荧光假病毒中和抗体检测方法...

作者：李相梅吉林大学

学位级别：硕士

人乳头瘤病毒(HPV)是已知最古老的病毒家族之一,能够导致上皮异常增生及宫颈癌和头颈部癌等多种癌症。HPV病毒颗粒具有保守的二十面体结构。研究表明,外源表达的HPV主要衣壳蛋白(L1)能够自发组装成病毒样颗粒(VLP),其表面存在HPV的主要... 详细信息

人乳头瘤病毒(HPV)是已知最古老的病毒家族之一,能够导致上皮异常增生及宫颈癌和头颈部癌等多种癌症。HPV病毒颗粒具有保守的二十面体结构。研究表明,外源表达的HPV主要衣壳蛋白(L1)能够自发组装成病毒样颗粒(VLP),其表面存在HPV的主要中和表位,具有高度的免疫原性,目前已上市或在研的HPV预防性疫苗均以HPV L1 VLP为其主要抗原成分。由于疫苗的高成本、高售价是限制其在发展中国家应用的主要因素,所以研发出价格低廉的高价次HPV预防性疫苗具有重要意义。此外,佐剂也是影响疫苗免疫效果的一个关键因素。因此,本论文拟通过对HPV6 L1蛋白原核表达条件进行优化以提高其可溶性表达量,并进行佐剂筛选以提高疫苗的免疫原性,为HPV VLP预防性疫苗的研发提供实验数据。本研究首先构建了原核表达质粒pET30a(+)-6L1,通过对诱导剂的使用量、诱导温度及共表达分子伴侣等三方面进行优化,确定最佳表达条件;之后选择Al(OH)、AlPO和Nano Al三种佐剂与HPV6 L1 VLP共同免疫,采用ELISA和中和试验进行免疫原性评价。结果显示:(1)适当降低蛋白合成速度能够增加目的蛋白可溶性表达量,当诱导剂IPTG使用终浓度为0.1mM、诱导温度为25℃时,HPV6 L1蛋白可溶性表达量更高;(2)分子伴侣TF对HPV6 L1蛋白可溶性表达的增强效果更佳;(3)四组疫苗均能提供较好的、较为持久的保护作用,其中Al(OH)佐剂组中和抗体水平明显高于其他佐剂组。免疫原性评价是HPV疫苗临床研究中的重要内容,但传统的中和抗体检测方法操作繁琐。当前国内外通用的HPV假病毒中和抗体检测方法是使用携带EGFP的假病毒,这就导致在进行九价免疫血清检测时,需通过九次单独试验,操作复杂且耗时长。本研究是在原有的基础上,选择三种激发、发射波长互不干扰的荧光蛋白EGFP、mTagBFP2、mRFP,用不同型别的假病毒包裹不同颜色的荧光蛋白基因,制备三种单色荧光假病毒PsV6G、PsV16B、PsV52R。通过分别使用单色荧光和三色混合荧光假病毒检测HPV九价疫苗免疫小鼠血清的中和抗体水平,以验证三色混合荧光假病毒检测系统的准确性。结果显示:(1)单色荧光、三色混合荧光假病毒检测试验的板内变异系数(CV)小于10%,板间变异系数(CV)小于20%,说明试验重复性较好;(2)单色荧光与三色混合荧光假病毒检测中和抗体滴度值无统计学差异(P>0.05),说明两种检测方法具有一致性,且三色混合荧光假病毒检测免疫血清不存在干扰现象。本研究的结果表明,三色混合荧光假病毒中和抗体检测方法能够应用于HPV九价免疫血清中和抗体的检测,这为一种基于荧光信号的高通量HPV假病毒中和抗体检测方法的建立提供了新思路,为高效、快速地检测HPV九价疫苗临床血清奠定了坚实基础。

关键词：人乳头瘤病毒分子伴侣佐剂三色混合荧光假病毒中和抗体

基于序列和启动子改进的CA16 VLP表达量提升及其免疫原性检测

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基于序列和启动子改进的CA16 VLP表达量提升及其免疫原性检测

作者：刘春天吉林大学

学位级别：硕士

手足口病(hand,foot and mouth disease)作为一种婴幼儿易感的病毒性传染性疾病,其主要病原体是CA16(Coxsackievirus A16)和EV71(Enterovirus 71)。手足口病的流行并不具有明显的地域性,因此在全球范围内均有流行。该病多数病例伴随较... 详细信息

手足口病(hand,foot and mouth disease)作为一种婴幼儿易感的病毒性传染性疾病,其主要病原体是CA16(Coxsackievirus A16)和EV71(Enterovirus 71)。手足口病的流行并不具有明显的地域性,因此在全球范围内均有流行。该病多数病例伴随较为温和的临床症状,但是不乏严重神经系统疾病及死亡病例的出现。近年来亚太地区,尤其是中国爆发的大流行俨然使得手足口病成为儿童公共健康的最大威胁。缺乏特异性的治疗方法和有效的预防控制手段使得研发有效的疫苗预防该病的流行已是共识。中国大陆于2016年3月正式批准了EV71全病毒灭活疫苗上市,该疫苗对EV71引起的重症疾病具有良好的保护力,可有效预防EV71引发的手足口病。但此疫苗对于CA16感染缺乏交叉保护力,加之近年来手足口病流行呈现出CA16、EV71交叉流行的趋势,使得研发CA16疫苗刻不容缓。病毒样颗粒(Virus Like Particle,VLP)由于不含有病毒核酸,保留病毒完整的蛋白外壳,具有较好的免疫原性及安全性,已经逐渐成为疫苗研发的新候选形式。相比EV71 VLP疫苗的发展,CA16 VLP疫苗受限于较低的表达量而大幅滞后。因此,本论文选取昆虫杆状病毒表达系统并结合基因序列和启动子的改进拟解决该问题。因此,在昆虫杆状病毒表达系统基础上,对CA16 P1序列进行密码子优化(P1ori和P1opt),3CD序列进行替换(3CD和BJ3CD),并用ECMV启动子替换pFastBacTM Dual载体中P10(P10和Enhancer CMV,ECMV)。构建不同优化设计的重组质粒并摸索优化表达条件筛选得到一个高表达量的质粒,从而突破CA16VLP表达量低这一瓶颈,同时对纯化的CA16 VLP的抗原性及免疫原性进行评估。最终,本论文基于Bac-to-Bac系统共设计构建了Y(P1ori-3CD-PFD),BY(P1ori-BJ3CD-PFD),BU(P1opt-BJ3CD-PFD),BEY(P1ori-ECMV-BJ3CD-PFD),BEU(P1opt-ECMV-BJ3CD-PFD)5种重组质粒,并摸索优化了表达温度,收获时间及感染复数三个基本参数,最终确定蛋白表达优化参数为T=21℃,MOI=0.1,TOH=120 h。在这个优化参数下进行CA16 VLP的表达,重组质粒BU实现了表达量约5.7倍的提升,从原始表达量2.60 mg/L提高到14.7 mg/L。更为重要的是纯化的CA16 VLP与CA16灭活病毒颗粒具有相似的结构并在小鼠体内诱导产生较高的中和抗体和IgG抗体。高表达量的重组质粒设计和优化的表达参数会加快CA16 VLP量产的步伐。同时,ECMV启动子的调节作用减缓了昆虫细胞裂解及内容物的释放,从而促进了VLP蛋白分泌表达。综上所述,本论文的工作对提高CA16 VLP表达量做了一次有意义的尝试,并为解决CA16 VLP疫苗的生产瓶颈提供了途径。

关键词：科萨奇病毒A型16 病毒样颗粒表达优化 Bac-to-Bac系统免疫原性

流感减毒活疫苗生产用毒株的基因遗传稳定性研究

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流感减毒活疫苗生产用毒株的基因遗传稳定性研究

作者：刘黎红吉林大学

学位级别：硕士

流行性感冒是由甲（A）、乙（B）、丙（C）三型流感病毒分别感染引起的急性呼吸道传染病。甲、乙两型流感病毒基因组由8个单链负链RNA节段组成，丙型流感病毒则缺少一个编码NA的RNA节段。不同的RNA节段编码不同的蛋白质，拥有特定的生... 详细信息

流行性感冒是由甲（A）、乙（B）、丙（C）三型流感病毒分别感染引起的急性呼吸道传染病。甲、乙两型流感病毒基因组由8个单链负链RNA节段组成，丙型流感病毒则缺少一个编码NA的RNA节段。不同的RNA节段编码不同的蛋白质，拥有特定的生物学功能，进而决定流感病毒的遗传特性。流感病毒的变异，包括致病性变异、抗原性变异、相变异等方面。致病性变异包括宿主适应性变异、条件致病性变异和冷适应变异，抗原性变异主要是指HA和NA抗原的变异，主要有抗原漂移和抗原转换两种形式。因流感病毒的抗原易发生变异，曾多次引起过世界性的流感大流行，给人类带来巨大灾难。预防流感和控制其流行的最有效措施就是接种流感疫苗。根据流感灭活疫苗的有效成分，可将其分为流感全病毒灭活疫苗、流感病毒裂解疫苗、流感病毒亚单位疫苗。目前使用的流感灭活疫苗主要是针对A型H1N1、A型H3N2和B型流感病毒的三联疫苗，使用安全，且具有较好的免疫效果。流感减毒活疫苗是将亲代减毒株（常为冷适应株）的六个内部基因(PB2、PB1、PA、NP、M、NS)和目前流行病毒株的两个基因（HA和NA）进行重配后得到的流感病毒减毒株制得的，既具有供体冷适应病毒株的温度敏感、冷适应、减毒的特点,又有流行病毒株的抗原特性。目前已批准上市的流感减毒活疫苗有美国的FluMistTM和俄罗斯的LAIV。由于流感病毒属于节段性RNA病毒，基因重组率高，非常容易发生突变而改变其抗原。流感疫苗减毒株制备成流感减毒活疫苗应用于人群后，必须保证其基因的遗传稳定性，才能保证疫苗作用于人体仍然能维持其基本特征，使用后不能使人致病，且能产生良好的免疫保护。因此流感病毒减毒株基因的遗传稳定性对于疫苗生产用毒株来说是非常重要，只有基因遗传稳定才能保证疫苗的安全性和有效性。本实验研究的目的就是研究流感减毒活疫苗生产用毒株基因的遗传稳定性。本实验将A/17/California/2009/38(H1N1)、 A/17/Perth/09/87(H3N2)及B/56/Brisbane/60/08三株流感病毒减毒株分别接种于鸡胚尿囊腔中进行连续传代培养，选取第2、3、5、10代毒株，采用分子生物学的方法，提取病毒的全部基因RNA，通过逆转录成cDNA，PCR扩增后连入载体构建质粒，将质粒转入大肠杆菌后提取阳性单克隆进行培养，再提取质粒送测序。将A/17/California/2009/38、A/17/Perth/09/87、B/56/Brisbane/60/08这3种病毒4个代次共12株病毒株的PB2、PB1、PA、NP、M、NS等6个基因与其亲本减毒株A/Leningrad/134/17/57(H2N2)、B/USSR/60/69相同基因进行基因全序列和氨基酸全序列比对;将A/17/California/2009/38、 A/17/Perth/09/87、B/56/Brisbane/60/08这3种病毒4个代次共12株病毒株的HA和NA这2个基因与WHO推荐的适用于北半球的2011～2012年相应流感减毒病毒株anA/California/07/2009(H1N1)-like virus、an A/Perth/16/2009(H3N2)-likevirus、a B/Brisbane/60/2008-like virus进行基因全序列和氨基酸全序列比对，比对结果显示，病毒在传代的过程中出现了核苷酸和氨基酸的突变，但突变率非常低，甲型流感病毒的总突变率仅为0.035%，乙型流感病毒的总突变率仅为0.022%，说明该病毒株与対比株同源性大于99%，且连续传代10代次内基因遗传稳定。将A/17/California/2009/38、A/17/Perth/09/87、B/56/Brisbane/60/08的减毒特征基因关键位点的核苷酸和氨基酸序列与其亲本减毒株A/Leningrad/134/17/57(H2N2)、B/USSR/60/69相应位点的核苷酸和氨基酸序列进行比对，比对结果显示，各代次流感病毒株关键减毒位点并没有出现核苷酸和氨基酸的改变。说明这三株病毒株连续传代10代次内基因遗传稳定，减毒特性没有改变。本实验可以证明A/17/California/2009/38、 A/17/Perth/09/87、B/56/Brisbane/60/08这三种病毒均为基因遗传性稳定的病毒，符合国家对流感减毒活疫苗生产用毒种的要求，可以保证疫苗在基因遗传稳定性方面的安全性和有效性。

关键词：流感病毒减株 A/17/California/2009/38 A/17/Perth/09/87 B/56/Brisbane/60/08 遗传稳定性

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水痘疫苗免疫策略研究

水痘疫苗免疫策略研究

作者：陶航吉林大学

学位级别：硕士

目的：评价不同时间间隔接种2剂水痘减毒活疫苗的安全性、免疫效果和免疫原性。方法：将1200名1-12岁儿童按照随机对照原则进行分组。分成两组，分别为治疗组和对照组。治疗组接种2剂冻干水痘减毒活疫苗，时间间隔分别为3个月和6个月，... 详细信息

目的：评价不同时间间隔接种2剂水痘减毒活疫苗的安全性、免疫效果和免疫原性。方法：将1200名1-12岁儿童按照随机对照原则进行分组。分成两组，分别为治疗组和对照组。治疗组接种2剂冻干水痘减毒活疫苗，时间间隔分别为3个月和6个月，并在免前和免后第7周采集血清样本。对照组全部接种乙肝疫苗，采血时间同治疗组。用膜抗原荧光抗体法（FAMA）检测血清水痘抗体水平;此外，观察每组免后的安全性和免疫原性。结果：免前抗体同年龄组对照组和实验组间血清抗体滴度无统计学差异。同年龄组对照组免前、接种1剂后、2剂后血清抗体滴度无统计学差异。试验组中同年龄组，间隔6个月和3个月接种2剂后血清抗体滴度无统计学差异。血清阳转率亦无统计学差异。接种1剂和2剂水痘疫苗后，1-3岁组、4-6岁组、7-12岁组阳转率分别为92.77%，92.06，88.17%,99.04%,97.35%和95.70%。

关键词：水痘疫苗安全性免疫原性两针免疫