基于H2O2灭活的H3N2亚型流感病毒疫苗的研究

作     者：孙捷 

作者单位：吉林大学 

学位级别：硕士

导师姓名：姜春来

授予年度：2023年

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100102[医学-免疫学] 10[医学] 

主      题：A(H3N2)亚型流感病毒 甲醛 过氧化氢 灭活疫苗 抗原性 免疫原性 保护性 

摘      要：蛋白构象决定疫苗的免疫原性。在对病毒进行灭活处理过程中,需要加入不同的灭活剂,灭活剂会与蛋白相互作用,从而对病毒构象产生影响,进而影响疫苗的免疫原性。甲醛(Formaldehyde,FA)是最常用的灭活剂,主要作用于病毒表面蛋白,导致蛋白发生交联,影响抗原表位的呈现;而过氧化氢(HO)可以利用其羟基自由基攻击核苷中的碳双键或主干氢原子造成病毒基因组损伤从而发挥灭活作用,可能对病毒蛋白及结构影响小。由于FA和HO对病毒的作用方式不同,制备的灭活疫苗的免疫原性也会有所区别。流感病毒呈季节性流行且频繁突变,每年全球范围内大约有29～64万人因流感感染而死亡。预防流感的有效方法是疫苗接种,但市售季节性流感疫苗不能提供持久以及广谱的保护,所以研发高质量的流感病毒疫苗迫在眉睫。当前,季节性流感主要由甲型流感病毒(Influenza A Virus,IAV)引起,以H3N2和H1N1亚型流感病毒为主。本研究以H3N2为对象,进行了HO和FA灭活条件的探索。在鸡胚中进行疫苗灭活验证发现,不同灭活剂的作用时间不同,1%HO完全灭活H3N2需要4小时,而0.02%FA需要5天。本研究用上述灭活条件制备了HO灭活-H3N2(Hi-H3N2)和FA灭活-H3N2(Fi-H3N2)疫苗并进行体外表征。首先本研究通过检测HO残留量评价了Hi-H3N2的安全性,Hi-H3N2中HO含量为27μM。其次,为了评价HO和FA灭活对H3N2主要保护性抗原蛋白血凝素(Hemagglutinin,HA)的影响,比较了灭活前H3N2、Hi-H3N2和Fi-H3N2的血凝效价和蛋白含量。Hi-H3N2的血凝效价和蛋白含量高于Fi-H3N2,说明HO灭活对H3N2 HA的影响较小,有利于工艺的开发。最后,为了研究HO和FA灭活对HA表位的影响,对一定HA蛋白含量的灭活前H3N2、Hi-H3N2和Fi-H3N2进行体外抗原性检测,结果发现,Hi-H3N2的OD值显著高于Fi-H3N2,使用HO灭活较FA在保持抗原完整性上更具有优势。为了探究Hi-H3N2和Fi-H3N2灭活疫苗的免疫原性影响,本研究将Hi-H3N2和Fi-H3N2分别辅以MF59佐剂对BALB/c小鼠进行两次免疫,从Ig G抗体和血凝抑制(Hemagglutinin Inhibition,HI)抗体水平、IFN-γT细胞数目3个方面进行评价。在加强免疫后Hi-H3N2疫苗接种所产生的HI抗体是Fi-H3N2疫苗的1.6倍,Hi-H3N2疫苗组小鼠单个淋巴细胞刺激后产生的IFN-γT细胞数目显著高于Fi-H3N2组。结果表明,Hi-H3N2疫苗接种不仅显著增强机体中和抗体反应,而且能够促进细胞免疫反应的产生。接着,在加强免疫后2周进行鼻内感染10 EID同亚型病毒株H3N2,通过检测体重变化、肺部病毒载量和病理切片来进行保护性评价。攻毒保护性试验结果显示,相比较Fi-H3N2,Hi-H3N2能显著抑制H3N2在小鼠肺部组织的复制。综上,本论文以H3N2为例,制备了FA和HO两种灭活剂的流感灭活疫苗,通过抗原性、免疫原性和保护性评价比较,评估了FA和HO灭活在H3N2流感疫苗制备中对病毒的影响。本研究为流感灭活疫苗的进一步研究奠定了良好基础,同时也对其他病毒的灭活处理及灭活剂的相关评价具有一定的指导意义。