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非洲猪瘟病毒H108R蛋白的制备及其免疫原性评价

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畜牧兽医学报 2025年

作者：张越茹毅郝荣增杨锐赵陇和李亚军杨洋张荣蒋成辉郑海学中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃农业大学动物医学院

本研究旨在制备ASFV H108R蛋白，通过免疫小鼠评价该蛋白的免疫原性，为该蛋白作为疫苗候选抗原的研究提供理论依据。利用生物信息学工具分析H108R蛋白的结构及基本理化性质，选择编码蛋白33-108 AA的基因序列串联融合到原核表达载体，... 详细信息

本研究旨在制备ASFV H108R蛋白，通过免疫小鼠评价该蛋白的免疫原性，为该蛋白作为疫苗候选抗原的研究提供理论依据。利用生物信息学工具分析H108R蛋白的结构及基本理化性质，选择编码蛋白33-108 AA的基因序列串联融合到原核表达载体，转化后经IPTG诱导表达，用镍亲和层析纯化目标蛋白质。免疫小鼠利用流式细胞术检测脾脏活化的CD4+和CD8+T淋巴细胞，分离小鼠血清测定特异性抗体滴度，利用WB和IFA鉴定多克隆抗体的特异性。并用试剂盒检测血清中细胞因子含量，将血清与ASFV-GFP病毒孵育评估抗体是否能抑制病毒的复制。生物信息学分析表明H108R蛋白为亲水性蛋白质，有跨膜区，无信号肽，蛋白二三级结构中存在较多α-螺旋。SDS-PAGE、Western blotting显示IPTG诱导后，成功表达纯化H108R蛋白。蛋白免疫小鼠后能够诱导小鼠脾脏T细胞的活化，刺激机体产生更高水平的细胞因子。免疫制备的多克隆抗体效价为1∶128 000，能与ASFV-GFP病毒特异性结合，与病毒孵育后能明显抑制病毒的复制。本研究成功表达制备了ASFV H108R蛋白，免疫能够诱导脾脏T淋巴细胞活化，引起细胞因子水平升高，制备的多克隆抗体能够明显抑制病毒的复制，具有较好的免疫原性，为深入研究H108R蛋白的生物学功能及疫苗研究奠定基础。

关键词：非洲猪瘟病毒(ASFV) H108R蛋白多克隆抗体免疫原性

非洲猪瘟病毒p34蛋白重组纳米颗粒的制备及免疫原性评价

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农业生物技术学报 2025年第1期33卷 228-236页

作者：张荣茹毅蒋成辉张越赵冬梅郝荣增李亚军郑海学刘学荣杨进才安兰芳魏彦明甘肃农业大学动物医学院中国农业科学院兰州兽医研究所/动物疫病防控全国重点实验室中农威特生物科技股份有限公司

铁蛋白纳米颗粒具有可展示多抗原的表面，能更好的促进细胞摄取和抗原呈递，进而增强免疫效力而被广泛应用于疫苗研究。本研究旨在利用铁蛋白制备携带非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV) p34蛋白的纳米颗粒抗原，并评价其免... 详细信息

铁蛋白纳米颗粒具有可展示多抗原的表面，能更好的促进细胞摄取和抗原呈递，进而增强免疫效力而被广泛应用于疫苗研究。本研究旨在利用铁蛋白制备携带非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV) p34蛋白的纳米颗粒抗原，并评价其免疫原性，为非洲猪瘟纳米疫苗研究提供参考。首先，将编码p34蛋白和SpyTag(ST)标签的基因序列串联后插入pET-28a(+)载体得到pET-p34-ST重组质粒，将编码Spycatcher(SC)与铁蛋白(ferritin, F)的基因序列串联后插入pET-28a(+)载体得到pET-SC-F重组质粒，并分别在大肠杆菌(Escherichia coli)中诱导表达。然后通过亲和层析法纯化2种重组蛋白p34-ST和SC-F后，进行体外偶联得到重组纳米颗粒F-p34。利用SDS-PAGE、Western blot、动态光散射(dynamic light scattering, DLS)、投射电子显微镜(transmission electron microscopy, TEM)等方法对制备的F-p34进行鉴定和形态表征，最后通过免疫BALB/c小鼠(Mus musculus)进行体内免疫原性评价。结果显示，本研究成功设计并构建了pET-28a-p34-ST和pET-28a-SC-F原核表达载体，经过体外表达、纯化和偶联，成功制备出偶联非洲猪瘟病毒p34蛋白的铁蛋白纳米颗粒F-p34，其与ASFV阳性血清能够发生特异性反应，DLS和TEM体外表征发现，F-p34粒径大约为21 nm，且具有均一的纳米颗粒结构；F-p34免疫小鼠后7 d即可诱导机体产生特异性免疫应答，在42 d时抗体滴度达到最高且显著高于单体抗原p34免疫组(P免疫组脾淋巴细胞的增殖水平和血清中细胞因子白细胞介素4(interleukin 4, IL-4)、IL-10、IL-2和干扰素γ(interferon, IFN-γ)的分泌水平显著高于p34免疫组(P免疫原性的携带非洲猪瘟病毒p34蛋白的纳米颗粒抗原，拓宽了非洲猪瘟亚单位疫苗的研究思路。

关键词：非洲猪瘟病毒(ASFV) p34蛋白铁蛋白纳米颗粒偶联免疫原性

非洲猪瘟病毒H108R蛋白的制备及其免疫原性评价

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畜牧兽医学报 2025年第3期56卷 1344-1354页

作者：张越茹毅郝荣增杨锐赵陇和李亚军杨洋张荣蒋成辉郑海学中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室兰州730000 中农威特生物科技股份有限公司兰州730046

本研究旨在制备ASFV H108R蛋白,通过免疫小鼠评价该蛋白的免疫原性,为该蛋白作为疫苗候选抗原的研究提供理论依据。利用生物信息学工具分析H108R蛋白的结构及基本理化性质,选择编码蛋白33~108 AA的基因序列串联融合到原核表达载体,转化... 详细信息

本研究旨在制备ASFV H108R蛋白,通过免疫小鼠评价该蛋白的免疫原性,为该蛋白作为疫苗候选抗原的研究提供理论依据。利用生物信息学工具分析H108R蛋白的结构及基本理化性质,选择编码蛋白33~108 AA的基因序列串联融合到原核表达载体,转化后经IPTG诱导表达,用镍亲和层析纯化目标蛋白质。免疫小鼠利用流式细胞术检测脾脏活化的CD4^(+)和CD8^(+)T淋巴细胞,分离小鼠血清测定特异性抗体滴度,利用Western blot和IFA鉴定多克隆抗体的特异性。并用试剂盒检测血清中细胞因子含量,将血清与ASFV-GFP病毒孵育评估抗体是否能抑制病毒的复制。生物信息学分析表明H108R蛋白为亲水性蛋白质,有跨膜区,无信号肽,蛋白二三级结构中存在较多α-螺旋。SDS-PAGE、Western blot显示IPTG诱导后,成功表达纯化H108R蛋白。蛋白免疫小鼠后能够诱导小鼠脾脏T细胞的活化,刺激机体产生更高水平的细胞因子。免疫制备的多克隆抗体效价为1∶128000,能与ASFV-GFP病毒特异性结合,与病毒孵育后能明显抑制病毒的复制。本研究成功表达制备了ASFV H108R蛋白,免疫能够诱导脾脏T淋巴细胞活化,引起细胞因子水平升高,制备的多克隆抗体能够明显抑制病毒的复制,具有较好的免疫原性,为深入研究H108R蛋白的生物学功能及疫苗研究奠定基础。

关键词：非洲猪瘟病毒(ASFV) H108R蛋白多克隆抗体免疫原性

猪胸膜肺炎放线杆菌OmpD、LppB蛋白的原核表达及免疫原性分析

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畜牧兽医学报 2025年第1期56卷 343-352页

作者：曾焱欧祥龙闫晓阳刘灿廖永洪西南大学动物医学院重庆402460 国家生猪技术创新中心重庆402460

本研究旨在评价猪胸膜肺炎放线杆菌OmpD和LppB蛋白的免疫原性和保护效果。通过同源性分析,发现19个血清型的APP均含有ompD和lppB基因,氨基酸序列相似性分别为98.2%~100%和99.3%~100%。利用基因工程大肠杆菌表达纯化了1型菌株的rOmpD和rL... 详细信息

本研究旨在评价猪胸膜肺炎放线杆菌OmpD和LppB蛋白的免疫原性和保护效果。通过同源性分析,发现19个血清型的APP均含有ompD和lppB基因,氨基酸序列相似性分别为98.2%~100%和99.3%~100%。利用基因工程大肠杆菌表达纯化了1型菌株的rOmpD和rLppB蛋白,并进行了免疫原性分析。结果显示,两种蛋白均能有效表达,与猪康复血清反应明显。小鼠免疫rOmpD、rLppB蛋白后,ELISA抗体水平显著提高,对国内流行的1型、7型菌株攻毒保护率为70%~80%。进一步制备含rOmpD和rLppB的油乳剂,免疫仔猪后,ELISA抗体水平显著提高,对1型、7型菌株攻毒具有部分保护作用和交叉保护能力,但未能完全阻止感染和死亡。因此OmpD、LppB有作为APP亚单位疫苗开发候选抗原的潜力,本研究为进一步开发具有良好交叉保护效果的疫苗提供了数据支持。

关键词：猪胸膜肺炎放线杆菌 OmpD LppB 免疫原性免疫效果

牛副流感3型病毒样颗粒的制备及免疫原性评价

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中国兽医学报 2025年第3期 404-411+442页

作者：朱晨曦黄向月朱庆丁露邓梏男阿克阿加贺春赛马元珍吴锦波张朝辉张斌西南民族大学畜牧兽医学院阿坝藏族羌族自治州畜牧科学技术研究所四川省甘孜藏族自治州动物疫病预防控制中心青藏高原动物遗传资源保护与利用教育部/四川省重点实验室

针对牛副流感病毒3型(bovine parainfluenza virus type 3,BPIV3)的基质蛋白(M)和血凝素-神经氨酸酶(HN)基因进行密码子优化并构建重组穿梭质粒Dual-M+HN;使用杆状病毒表达系统制备BPIV3病毒样颗粒(virus-like particles, VLPs),并采用Western blot、间接免疫荧光和电镜对其进行验证；将验证成功的VLPs与MF59佐剂和CpG-ODN免疫增强剂混合通过肌注方式免疫小鼠。通过检测小鼠血清特异性抗体、中和抗体和血凝抑制抗体来评估BPIV3 VLPs的免疫效果。结果显示，优化后的M和HN蛋白基因密码子适应指数(codon adaptation index, CAI)分别为0.96和0.95,CG含量分别达到54.1%和53.1%;构建的重组质粒转化至DH10Bac进行蓝白斑筛选，将验证正确的重组杆粒转染至Sf9细胞，获得杆状病毒pFastBac-M+HN,电镜下观察可见直径约180 nm的BPIV3 VLPs; IFA和Western blot试验均证明目的蛋白的成功表达并具有生物学活性；通过蛋白优化发现感染剂量MOI=5时蛋白表达量最高；将50μg VLPs与MF59佐剂和CpG-ODN混合后肌注方式免疫小鼠，结果显示VLPs免疫组在首免2周时抗体开始上升，在二免后21 d时达到最高，平均IgG抗体滴度为1∶40 228,中和抗体滴度平均为1∶298,血凝抑制抗体滴度为1∶549,达到灭活苗水平(P≥0.05),表明本试验制备的VLPs能诱导机体产生体液免疫反应。结果表明，本试验成功制备了能自组装表达BPIV3 HN和M蛋白的VLPs,并能诱导小鼠机体产生体液免疫反应，为后续BPIV3 VLPs疫苗研究奠定了基础。

关键词：牛副流感病毒3型基质蛋白(M) 血凝素-神经氨酸酶(HN) 病毒样颗粒免疫原性

细胞基质四价流感病毒亚单位疫苗配伍纳米乳佐剂在不同鼠龄段BALB/c小鼠体内的免疫原性

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中国生物制品学杂志 2025年第3期 264-271+278页

作者：家峥王红红刘莹闫伊萌李雪娇郭丹丹赵帅吴业红张雪梅长春生物制品研究所有限责任公司新突发传染病新型疫苗研发全国重点实验室武威市药品检验检测中心北京生物制品研究所有限责任公司

目的评价纳米乳佐剂（nano-emulsion adjuvant,NE）配伍细胞基质四价流感病毒亚单位疫苗（cell-based quadrivalent influenza subunit vaccine,QIVc）对小鼠体液免疫的增强作用。方法以NE（50μL）配伍QIVc，肌内注射免疫3周龄、6周... 详细信息

目的评价纳米乳佐剂（nano-emulsion adjuvant,NE）配伍细胞基质四价流感病毒亚单位疫苗（cell-based quadrivalent influenza subunit vaccine,QIVc）对小鼠体液免疫的增强作用。方法以NE（50μL）配伍QIVc，肌内注射免疫3周龄、6周龄、18月龄BALB/c雌性小鼠，免疫剂量为血凝素（hemagglutinin,HA）1.5μg/（株·只），2针免疫间隔28 d。初次免疫后28 d及末次免疫后14 d，检测小鼠血清中血凝抑制（hemagglutination inhibition,HI）效价和IgG抗体水平，分析3种鼠龄段小鼠的佐剂增强作用，同时设无佐剂及PBS对照组。末次免疫后14 d，以10倍病毒半数致死量(median lethal dose,LD50)B/Maryland/15/2016（B-Victoria）流感毒株进行攻毒试验，连续14 d观察小鼠体质量和生存率变化。结果 NE联合HA肌内注射免疫可诱导比单独HA肌内注射免疫更高水平的血清HI、IgG抗体，在18月龄小鼠中的免疫增强作用更明显；NE能够增强HA的免疫原性以及小鼠对B/Maryland/15/2016（B-Victoria）流感毒株攻击的抵抗力。结论 NE可增强流感抗原的免疫原性，且对老龄小鼠的增强作用更明显。

关键词：四价流感病毒亚单位疫苗纳米乳佐剂鼠鼠龄免疫原性

冻干甲型肝炎减毒活疫苗(H_(2)株)上市后临床Ⅳ期试验安全性及免疫原性评价

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中国生物制品学杂志 2025年第1期38卷 42-47页

作者：程诚钱汶王龙龙温佳楠张涛汪小东丁利平毛子安浙江普康生物技术股份有限公司浙江杭州310053

目的评价冻干甲型肝炎减毒活疫苗(H_(2)株)上市后的安全性和免疫原性,以期作为免疫规划疫苗推广使用。方法对5000例18~24月龄健康婴幼儿接种1剂冻干甲型肝炎减毒活疫苗,观察接种后0~14 d的不良事件,其中200例入选免疫原性亚组,检测免疫... 详细信息

目的评价冻干甲型肝炎减毒活疫苗(H_(2)株)上市后的安全性和免疫原性,以期作为免疫规划疫苗推广使用。方法对5000例18~24月龄健康婴幼儿接种1剂冻干甲型肝炎减毒活疫苗,观察接种后0~14 d的不良事件,其中200例入选免疫原性亚组,检测免疫前后8周血清中甲型肝炎病毒(hepatitis A virus,HAV)特异性IgG抗体水平。结果5000例完成入组接种,4999例完成安全性观察。报告征集性不良反应424例,不良反应发生率8.48%,征集性局部不良反应以接种部位红晕、触痛、瘙痒、皮疹、肿胀为主,征集性全身不良反应以发热、厌食为主,严重程度以1~2级为主,未发生与疫苗有关的严重不良事件。200例免疫原性亚组中有188例受试者纳入符合方案集(per protocol set,PPS),抗体阳转率为98.91%[95%可信区间(confidence interval,CI):96.11%~99.87%],HAV特异性IgG抗体几何平均滴度(geometric mean titer,GMT)为83.67 mIU/mL(95%CI:77.05~90.85 mIU/mL)。结论单剂冻干甲型肝炎减毒活疫苗(H_(2)株)对18~24月龄婴幼儿具有良好的安全性和免疫原性。

关键词：冻干甲型肝炎减毒活疫苗(H_(2)株) 临床试验安全性免疫原性

Bac-to-Bac TOPO系统表达甲型流感病毒核蛋白及其免疫原性评价

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中国生物制品学杂志 2025年第3期 257-263页

作者：孙可为吴业红乔永波尹婷孙立影邹墅长春生物制品研究所有限责任公司新突发传染病新型疫苗研发全国重点实验室

目的采用Bac-to-Bac TOPO系统表达甲型流感病毒核蛋白（nucleoprotein,NP），并评价其免疫原性，以期为流感病毒NP疫苗的研究奠定基础。方法 PCR法扩增甲型H1N1（A/Guangdong-Maonan/SWL1536/2019＿CNIC-1909）流感病毒NP基因，连接至... 详细信息

目的采用Bac-to-Bac TOPO系统表达甲型流感病毒核蛋白（nucleoprotein,NP），并评价其免疫原性，以期为流感病毒NP疫苗的研究奠定基础。方法 PCR法扩增甲型H1N1（A/Guangdong-Maonan/SWL1536/2019＿CNIC-1909）流感病毒NP基因，连接至载体pFastBacTM/CT-TOPOTM，转化感受态*** One ShotTMMach1TMT1R，制备供体质粒，进行PCR及测序鉴定；将供体质粒转化感受态*** MAX EfficiencyTMDH10BacTM，通过蓝白斑筛选阳性单克隆，提取重组杆粒，进行PCR鉴定。将重组杆粒转染Sf9昆虫细胞，制备重组杆状病毒，流式细胞术检测病毒滴度。重组杆状病毒经多轮增殖后感染Sf9细胞，获得重组NP，并进行镍离子亲和层析纯化。将重组NP及PBS经皮下分别接种雌性BALB/c小鼠，每组6只，ELISA法检测小鼠血清特异性抗体水平，流式细胞术检测小鼠脾细胞分泌IFNγ水平，酶联免疫斑点法检测小鼠脾细胞产生CD4+和CD8+T淋巴细胞水平。末次免疫后2周，用A/Guangdong-Maonan/SWL1536/2019＿CNIC-1909流感病毒经小鼠鼻腔进行攻毒，监测攻毒后14 d内小鼠体质量变化及存活情况。结果 PCR及测序鉴定结果证明，供体质粒构建正确；PCR鉴定结果证明，重组杆粒构建成功。重组杆状病毒滴度为2.875×10～8ivp/mL。重组NP可与鼠抗甲型流感病毒NP单克隆抗体发生特异性结合，纯化后纯度达91.3%。末次免疫后2周，与PBS组比较，NA组小鼠血清特异性抗体滴度（t=0.288,P免疫原性，能产生较强的体液和细胞免疫反应，可为小鼠抵御流感病毒感染提供一定的保护。

关键词： Bac-to-Bac TOPO系统流感病毒核蛋白免疫原性杆状病毒昆虫细胞

截短型水痘带状疱疹病毒gE融合分子内佐剂的原核表达及其免疫原性

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沈阳药科大学学报 2025年第3期42卷 290-294页

作者：刘晓菲孙苓苓沈阳药科大学药学院

目的原核表达水痘带状疱疹病毒gE融合分子内佐剂的融合蛋白，并评价其免疫原性。方法以pET28-a质粒为载体，构建水痘带状疱疹病毒蛋白E(glycoprotein E,gE)融合破伤风毒素(tetanus toxoid, TT)通用表位P2基因，并将其转化至大肠杆菌... 详细信息

目的原核表达水痘带状疱疹病毒gE融合分子内佐剂的融合蛋白，并评价其免疫原性。方法以pET28-a质粒为载体，构建水痘带状疱疹病毒蛋白E(glycoprotein E,gE)融合破伤风毒素(tetanus toxoid, TT)通用表位P2基因，并将其转化至大肠杆菌中，经IPTG诱导表达，亲和色谱纯化，获得纯度较高的gE-TT蛋白。将gE-TT蛋白免疫小鼠，检测小鼠的血清特异性IgG抗体滴度，评价其免疫原性。结果构建的重组大肠杆菌工程菌经IPTG诱导能稳定的表达gE-TT蛋白，经分离纯化后，获得分子量约为62 kD的gE-TT蛋白，并能与anti-VZV gE抗体特异性结合；ELISA检测显示小鼠血清产生了较强的gE-TT特异性IgG抗体。结论本研究已在大肠杆菌系统中成功表达了重组gE-TT蛋白，该蛋白可有效引起小鼠的体液免疫反应，为水痘带状疱疹病毒的实验室研究和疫苗制备奠定基础。

关键词：水痘带状疱疹病毒 gE-TT抗原原核表达免疫原性