基于GLuc新型抗体检测技术的建立

作     者：马同辉 

作者单位：吉林大学 

学位级别：硕士

导师姓名：高峰;姜春来

授予年度：2014年

学科分类：1010[医学-医学技术（可授医学、理学学位）] 10[医学] 

主      题：庚型肝炎病毒 人类免疫缺陷病毒 Gaussia荧光素酶 E2蛋白 P24蛋白 

摘      要：Gaussia荧光素酶(GLuc)是分离于海洋桡脚类动物(Gaussia princeps)的新型荧光素酶。该荧光素酶能够催化腔肠素发出475nm的荧光。是目前己知的几种荧光素酶(Firefly Luciferase、Renilla Luciferase、Copepod Luciferase等)中,分子量最小的荧光素酶(约19.9KD),但却是目前发光强度最强的荧光素酶,因而在检测中具有广阔的应用前景。 GBV-C病毒(庚型肝炎病毒)是1995年从非甲-戊型肝炎病人体内,获得的新型病毒。起初,由于该病毒从未知病因的肝炎病人体内获得,因而认为其导致肝炎。但经过多年大量的流行病调查,发现该病毒在健康人中也有很大比例的分布,美国约2%-5%的健康人感染该病毒,但没有肝炎症状。最近,更是有大量实验证实该病毒复制的起始位置并不在肝脏,并通过体外实验证实该病毒可以在PBMC细胞中复制。但到目前为止,该病毒的具体复制起点仍然不清楚。且尚没有发现任何确切的疾病与该病毒相关,但大量的实验证实,GBV-C病毒具有-定的拮抗HIV病毒的作用,更是有实验证实,GBV-C的E2蛋白具有多种抗HIV的机制,NS3蛋白和NS5a蛋白以及抗GBV-C E2蛋白的抗体也有抗HIV的作用。 HIV病毒自1981年在美国发现以来,己造成全球超过1200万人死亡,并导致至少3000万人被感染,严重威胁着人类的健康。然而到目前为止,尚无针对艾滋病的有效治愈方法,被寄予厚望的艾滋病疫苗,却由于HIV病毒本身独具的特点,而屡遭挫折。 目前,针对上述两种病毒的检测主要依靠ELISA方法进行。对于GBV-C的检测,主要以检测抗GBV-C E2蛋白的抗体作为GBV-C阳性的重要依据,而GBV-C E2蛋白是GBV-C病毒的一种包膜蛋白,具有三个糖基化位点,有实验证明血清中的E2抗体不识别原核表达的E2蛋白,据推测血清中的E2抗体只识别E2的空间表位。而原核表达的E2蛋白,未进行正确的修饰,不具有正确的空间构象。而目前常用的检测抗E2抗体的抗原E2蛋白均是由真核表达的,虽然具有了正确的构象,能够进行检测。但真核表达系统蛋白的纯化需要耗费大量的时间和成本,不利于检测的开展。 本实验采用GLuc分别与GBV-C的E2蛋白以及HIV的P24蛋白融合表达,构建酶标E2蛋白和酶标P24蛋白。由于GLuc能够经高尔基体分泌表达,这样就可以直接对GBV-C E2蛋白进行糖基化,而P24蛋白无糖基化位点,不会被糖基化。而且,酶标蛋白分泌到上清中,可以吸取细胞培养上清直接应用于检测,省去了纯化等复杂的步骤。 本论文利用能够吸附IgG抗体的sProteinA免疫磁珠对血清中的抗体进行吸附,然后加入上述酶标蛋白对血清中的抗体进行检测,通过实验成功检测到了GBV-C阳性血清和HIV阳性血清,且阳性血清和阴性血清的荧光值有很大差异。通过上述方法建立了基于GLuc的抗GBV-C E2抗体和抗HIV P24抗体的检测方法,该方法相对于目前常规的ELISA,省去了蛋白纯化等复杂步骤,有利于检测方法的迅速建立,对于建立突发传染性疾病的检测方法具有一定的借鉴意义