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甲状腺癌中p-stat1和stat1蛋白表达及意义

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中华内分泌外科杂志 2014年第1期8卷 38-41页

作者：袁科宇沈国陈祝华钱光煜浙江省诸暨市人民医院普外科 311800

目的探讨p-stat1及stat1蛋白在甲状腺癌中的表达及其与肿瘤临床病理的关系.方法选取浙江省诸暨市人民医院江东普外科保存的甲状腺癌及对应癌旁组织80例,采用免疫组织化学Sp法检测磷酸化stat1（p-stat1）及stat1蛋白的表达,分析其与甲... 详细信息

目的探讨p-stat1及stat1蛋白在甲状腺癌中的表达及其与肿瘤临床病理的关系.方法选取浙江省诸暨市人民医院江东普外科保存的甲状腺癌及对应癌旁组织80例,采用免疫组织化学Sp法检测磷酸化stat1（p-stat1）及stat1蛋白的表达,分析其与甲状腺癌临床病理特征的关系;随访其中74例,观察p-stat1及stat1蛋白与甲状腺癌无复发生存率之间的关系.结果 p-stat1及stat1蛋白在甲状腺癌组织及正常甲状腺组织中的阳性表达率分别为28.8％（23/80）和90.0％（72/80）、85.0％（68/80）和50.0％（40/80）,差异均有统计学意义（p＜0.05）.相对于Ⅰ＋Ⅱ期甲状腺癌患者,p-stat1蛋白在Ⅲ＋Ⅳ期的甲状腺癌患者中显著下降（p＜0.05）,而stat1则无明显变化.p-stat1蛋白在有淋巴结转移的甲状腺癌中的阳性表达率显著低于无淋巴结转移者（p＜0.05）.p-stat1蛋白阳性患者中无复发生存率为100％,而stat1阳性的患者中为92.65％,提示p-stat1表达与甲状腺癌患者预后相关.结论 p-stat1蛋白表达与甲状腺癌的发生发展、浸润转移及无复发生存率相关,检测p-stat1蛋白的表达可能作为评估甲状腺癌预后和指导临床靶向治疗的重要指标.

关键词：甲状腺癌 p-stat1 stat1 转移

七味白术散对轮状病毒感染乳鼠小肠iEL CD3+T细胞质内p-JAK1、p-stat1蛋白表达的影响

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七味白术散对轮状病毒感染乳鼠小肠iEL CD3+T细胞质内p-JAK1、p-S...

卡泊三醇对银屑病患者JAK/stat信号转导途径的影响

第八届全国免疫学学术大会

作者：左胜男伍参荣蔡锐李珊申可佳田雪飞李杰湖南中医药大学

目的:观察七味白术散对H RV感染乳鼠小肠i EL CD3+T细胞质内p-JAK1、p-stat1蛋白表达的影响,探讨七味白术散可能通过IFN-γ的JAK/stat信号通路中发挥作用的机理。方法:5日龄乳鼠经口感染H RV建立腹泻模型,随机分为七味白术散组(BG)、病... 详细信息

目的:观察七味白术散对H RV感染乳鼠小肠i EL CD3+T细胞质内p-JAK1、p-stat1蛋白表达的影响,探讨七味白术散可能通过IFN-γ的JAK/stat信号通路中发挥作用的机理。方法:5日龄乳鼠经口感染H RV建立腹泻模型,随机分为七味白术散组(BG)、病毒唑组(VG)、抑制剂组(YG)、七味白术散加抑制剂组(BYG),病毒唑加抑制剂组(VYG)、模型组(MG),另设立正常对照组(CG)。模型组和正常组喂服生理盐水,其余五组乳鼠分别经口滴入相应药物。分别于用药后15min、1h、2h、6h、12h、24h、32h、48h处死乳鼠,取小肠粘膜,分离出CD3+T细胞,采用western blotting方法测定细胞质中p-JAK1、p-stat1的表达。药物治疗5天后取乳鼠粪便,梯度稀释后接种于MA104细胞培养,采用免疫荧光的方法观察细胞中阳性病毒颗粒,判断药物对肠道病毒的清除作用。结果:在同一时间点,七味白术散组乳鼠小肠粘膜i EL CD3+T细胞质p-JAK1蛋白和p-stat1蛋白的表达明显高于模型组、抑制剂组、七味白术散加抑制剂组,病毒唑加抑制剂组、正常组(pp>0.05)说明七味白术散对肠道H RV有良好的清除作用;同时BG乳鼠粪便H RV感染阳性病毒颗粒数与YG、BYG、VYG有显著差异(pp-JAK1,p-stat1蛋白的表达,这一结果表明七味白术散可能通过激活JAK/stat信号通路来发挥抑制H RV的作用。

关键词：七味白术散 HRV p-JAK1 p-stat1 IFN-γ

来源： cnki会议评论

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卡泊三醇对银屑病患者JAK/STAT信号转导途径的影响

作者：张丽南方医科大学

学位级别：硕士

研究背景：.银屑病(psoriasis)是最常见的慢性炎症性增生性皮肤病之一,病情顽固,易复发,且可造成全身系统损害。其主要的组织病理学改变为角质形成细胞异常增生、角化不全、角化过度、血管生成和炎性细胞浸润。其病因和发病机制尚未完... 详细信息

研究背景：.银屑病(psoriasis)是最常见的慢性炎症性增生性皮肤病之一,病情顽固,易复发,且可造成全身系统损害。其主要的组织病理学改变为角质形成细胞异常增生、角化不全、角化过度、血管生成和炎性细胞浸润。其病因和发病机制尚未完全明确,也无特效治疗药物,目前尚无有效根治方法,严重影响患者的生活质量,甚至生存周期,是目前国内外重点关注的疾病之一。研究多显示免疫平衡失调和(或)表皮角质形成细胞增生异常与其发病密切相关,其中细胞因子对角质形成细胞的增生和分化、病理和细胞动力学均有一定作用。目前已证实T细胞活化及T细胞一角质形成细胞调节水平异常等在银屑病发病机制中起着非常重要的作用,且其发病过程与多种炎症细胞、细胞因子及生长因子有关近年来JAK/stat信号转导通路与银屑病的关系受到越来越多的关注,大量的研究工作表明JAK/stat信号转导通路是细胞因子信息内传最重要的一条通道。活化的T细胞分泌的多种细胞因子与细胞表面相应受体结合,通过JAK/stat信号转导通路将胞外信号传递至胞核内,调节角质形成细胞等细胞的增殖和分化,从而在银屑病的发病过程中起到重要的作用。但stat转导机制的准确作用尚未完全清楚。国内外大量研究结果表明在银屑病皮损区,激活的T细胞可以产生一系列的细胞因子,而这些细胞因子与角质形成细胞表面相应受体结合后,可能引起角质形成细胞内角蛋白表达模式的改变。且研究发现K17蛋白(Keratin17,K17)在银屑病皮损中高表达,但在正常皮肤都未见表达,并已被认为是银屑病的标志物之一。其中细胞因子IFN-γ可激活stat1,诱导表皮基底层以上部分角质形成细胞表达角蛋白K17。而史晓蔚等研究也表明角质形成细胞中IL-17A可以通过stat1和stat3途径剂量依赖性的上调K17的表达。目前多数研究已表明,银屑病患者皮损的表皮中下层细胞的胞浆及胞核中高表达stat3蛋白,其在血液中的表达也显著升高,并且与病情的严重程度呈正相关。同时,有研究表明stat3的异常活化可以促进细胞分化增殖、抑制细胞凋亡,最终导致细胞增殖异常和(或)恶性转化,从而导致多种疾病的发生。提示stat3在银屑病发病中起重要作用。因此,stat1和stat3在角质形成细胞异常增殖的银屑病患者中是否存在高表达,并协同导致银屑病发病值得深入研究。近来,已清楚至少有三类不同的抑制蛋白与细胞因子信号转导的负调节有关。其中SOCS家族中许多成员是大多数细胞因子信号转导通路的负性调节因子,参与许多炎症性疾病免疫学发病。其中SOCS家族中的SOCS1, SOCS3在银屑病的发病过程中的作用越来越受到关注。研究发现SOCS1是IFN-信号活动的负性反馈调节因子,SOCS-3可以抑制IL-2引起的炎症反应,而IFN-、IL-2为角质形成细胞最强大的炎症前细胞因子,IFN-、IL-2通过诱导JAK-stat信号转导通路,形成角质形成细胞免疫炎性反应。尽管多数研究证实了JAK/stat及其负性调控因子在银屑病发病中的重要作用,然而其具体的作用机制尚未完全清楚,需要进一步深入探讨。卡泊三醇是1,25(OH)2D3的类似物,临床研究证实1,25(OH)2D3及其类似物治疗银屑病疗效确切。实验研究发现,其与骨化三醇受体有较强的亲合力,可减少银屑病患者的IL-6含量和分布,以及活化的表皮T淋巴细胞数。从而使银屑病皮损的增生和分化异常得以纠正。同时,也发现CpT的抗增殖效应与pRB的磷酸化有关,去磷酸化的pRB与UE2F等转录因子结合后,可使多种细胞周期调控蛋白和正性转录因子(如CyclinD1、CDK4、C-Myc)的表达降低,同时,CpT可促使TGF-β1的合成增加,而TGF-β1可以抑制CDK4等的表达。综合以上这些研究结果,JAK/stat信号转导途径在银屑病发病中作用机制及卡泊三醇对其的影响值得深入研究,是否可以提出卡泊三醇可能直接作用于JAK/stat信号转导途径,从而达到治疗银屑病的目的呢?为了解决上述问题,本研究以人角质形成细胞HaCaT细胞株为研究对象,利用RNA干扰技术,设计针对stat1/stat3的特异性siRNA,再将沉默序列转染至HaCaT细胞中,分别沉默stat1/stat3基因。然后,采用Q-pCR和Western-blot检测沉默后stat1/stat3沉默后的效果,筛选出最佳沉默序列,以期进一步探讨银屑病的发病机制及卡泊三醇治疗银屑病的作用机制。目的：1.通过RNA干扰技术建立stat3/stat1低表达的角质形成细胞,研究stat3/stat1的表达水平及负性调节因子(SOCS1/SOCS3)对银屑病的生物学影响及基因调控机制。2.探讨卡泊三醇对JAK/stat信号转导途径的影响,从

关键词：银屑病卡泊三醇 JAK/stat信号转导通路 stat1 stat3 p-stat1 p-stat1 SOCS1 SOCS3

CC1007靶向HDAC4复合物调节stat1逆转卵巢癌顺铂耐药的研究

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CC1007靶向HDAC4复合物调节STAT1逆转卵巢癌顺铂耐药的研究

作者：周睿琼中南大学

学位级别：硕士

目的：研究新型Ⅱa类HDAC抑制剂CC1007能否增强人卵巢癌细胞株HO8910、SKOV3、SKOV3/DDp对顺铂的敏感性及产生逆转耐药的作用,并初步探讨CC1007靶向HDAC4复合物调节stat1活性逆转卵巢癌顺铂耐药的可能机制。方法：1.采用体外诱导的方式... 详细信息

目的：研究新型Ⅱa类HDAC抑制剂CC1007能否增强人卵巢癌细胞株HO8910、SKOV3、SKOV3/DDp对顺铂的敏感性及产生逆转耐药的作用,并初步探讨CC1007靶向HDAC4复合物调节stat1活性逆转卵巢癌顺铂耐药的可能机制。方法：1.采用体外诱导的方式,取对数生长期SKOV3细胞在含顺铂的培养液中培养,逐渐增加药物浓度,诱导出耐药细胞株SKOV3/DDp。***比色法检测不同药物组干预HO8910、SKOV3、SKOV3/DDp细胞24h、48h、72h后细胞生长抑制率,实验分组设立空白组、对照组、单用顺铂组、单用CC1007组、顺铂联合CC1007组,计算半数抑制浓度(IC50),并绘制浓度-抑制率图形及时问-抑制率图形。实验重复3次。3.蛋白质印迹法分析不同药物组处理前后HDAC4、stat1、pstat1的表达情况。实验重复3次。4.实验所得数据应用SpSS17.0统计学软件进行统计学分析,pp细胞株,耐药指数RI=耐药细胞IC50/亲本细胞IC50=10.251(ug/ml)/3.081(ug/ml)=3.33。***比色法检测：(1).单用CC1007组：H08910细胞48h半数抑制浓度IC50为10.831±1.035μM,SKOV3细胞48h半数抑制浓度IC50为60.462±1.781μM, SKOV3/DDp细胞48h半数抑制浓度IC50为28.355土1.453μM。(2).单用顺铂组：H08910细胞24h半数抑制浓度IC50为5.492ug/ml,48h IC50为1.207ug/ml,72h IC50为0.762ug/ml;SKOV3细胞24h半数抑制浓度IC50为5.161ug/ml,48h IC50为3.081ug/ml,72h IC50为2.570ug/ml;SKOV3/DDp细胞24h半数抑制浓度IC50为32.817ug/ml,48hIC50为10.251ug/ml,72h IC50为6.470ug/ml。顺铂对三种卵巢癌细胞的抑制率呈明显浓度和时间依赖关系,三种卵巢癌细胞对顺铂敏感程度依次为：HO8910>SKOV3>SKOV3/DDp细胞。(3).顺铂联合CC1007组：5μM CC1007联合顺铂对H08910细胞48h顺铂半数抑制浓度IC50为0.476ug/ml;10μM CC1007联合顺铂对SKOV3细胞48h顺铂IC50为1.81ug/ml;10μM CC1007联合顺铂对SKOV3/DDp细胞48h顺铂IC50为3.572ug/ml。顺铂联合CC1007与单用顺铂两种用药方式比较差异有统计学意义(pp的顺铂增敏作用显著。3.蛋白质印迹法分析：(1).stat1基础表达量与三种细胞顺铂的IC50呈正相关;·(2).HDAC4表达水平与卵巢癌细胞顺铂耐药性呈正相关,耐药株SKOV3/DDp较其亲本株SKOV3的HDAC4表达量有所增加;(3).三种卵巢癌细胞中p-stat1基础表达量均不高,顺铂作用下,HDAC4低表达的H08910中p-stat1表达量无明显改变,HDAC4高表达的SKOV3/DDp中p-stat1表达量明显增加,CC1007抑制了顺铂诱导的p-stat1表达增加,在HDAC4高表达的SKOV3/DDp中抑制作用最显著。结论：1.低剂量CC1007能明显增强HO8910、SKOV3对顺铂的敏感性,且一定程度上逆转了耐药细胞株SKOV3/DDp耐药性。2. HDAC4表达水平与卵巢癌细胞的顺铂敏感性呈负相关,卵巢癌的顺铂耐药性与HDAC4高表达从而激活stat1(p-stat1表达增加)相关。***1007能靶向HDAC4复合物,抑制HDAC4复合物介导的stat1激活,发挥逆转卵巢癌顺铂耐药的作用。

关键词： CC1007 HDAC4 MEF2 stat1 p-stat1 化疗增敏耐药逆转

干燥综合征发病相关的关键基因及腺体中stat1活化的临床研究

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干燥综合征发病相关的关键基因及腺体中STAT1活化的临床研究

作者：刘玲玉厦门大学

学位级别：硕士

目的:目前干燥综合征(Sj(?)gren's syndrome,SjS)发病机制尚不清楚,本研究旨在分析SjS发病相关的关键基因,了解SjS发病机制中的关键致病通路,以及探索新的可用于诊断的指标。方法:使用整合生物信息学方法,例如稳健秩聚分析(Robust rank ... 详细信息

目的:目前干燥综合征(Sj(?)gren's syndrome,SjS)发病机制尚不清楚,本研究旨在分析SjS发病相关的关键基因,了解SjS发病机制中的关键致病通路,以及探索新的可用于诊断的指标。方法:使用整合生物信息学方法,例如稳健秩聚分析(Robust rank aggregation,RRA)、基因集富集分析(Gene set enrichment analysis,GSEA)等分析SjS患者的外周血、唾液腺组织和唾液上皮细胞的转录组数据,使用免疫组化染色法对SjS病例及对照组唇腺组织样本进行染色,分析IFN通路的活化标志,磷酸化的信号转导及转录激活蛋白1(phosphorylated Signal Transducer and Activator of Transcription 1,p-stat1)的异常表达。结果:整合生物信息学分析SjS患者外周血中上调基因的前10位是IFI44L、RSAD2、IFI44、IFI27、EpSTI1、IFIT1、IFIT3、IFI6、XAF1和MX1,它们的特征是与IFN应答相关。SjS患者唾液腺组织中上调基因的前10位是CXCL9、pTpRC、CXCL10、CXCL13、IFI44L、SAMHD1、CXCL11、XAF1、IFIT3 和CCL19,异常激活的通路主要包括IFN-α通路(富集分数(normalized enrichment score,NES)=1.95,错误发现率(False discovery rate,FDR)qp-stat1在SjS患者唇腺组织中存在异常增多(pp-stat1是我们的重点关注对象。通过免疫组化实验得出:与对照组相比,SjS患者唇腺组织中存在p-stat1异常改变,且无论是否形成淋巴灶,其p-stat1的表达水平均高于对照组,该现象可作为诊断病人是否患有SjS的另一重要指标,尤其是淋巴灶阴性的病人。以及探讨丝氨酸727(Serine 727,Ser727)位点的stat1磷酸化可能是SjS患者预防唾液腺破坏的潜在靶点。

关键词：干燥综合征 p-stat1 IFN 唇腺活检免疫组化

IL-27促进树突状细胞分化成熟及其作用机制的实验研究

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IL-27促进树突状细胞分化成熟及其作用机制的实验研究

作者：张璁河北医科大学

学位级别：硕士

目的：观察在白介素-27（Interleukin-27, IL-27）单独作用或与TNF-α（Tumor necrosis factor-α, TNF-α）的联合作用的情况下，对健康成年人外周血单个核细胞（peripheral blood monocyte, pBMC）来源的树突状细胞（Dendritic cell, DC）分化、成熟和生物学功能的影响，并探讨其作用机制。方法：1.采集正常健康人外周血15～20ml，用Ficoll-hypaque（葡聚糖-泛影葡胺）密度梯度离心法分离出外周血单个核细胞，加入基础细胞因子粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（Granulocyte-macrophage colony stimulatingfactor, GM-CSF）和IL-4体外培养5d，得到未成熟的DC。在第5d时加入刺激因子，并根据加入刺激因子的不同分为四个实验组，分别为：阴性对照组（Negative：不加入任何刺激因子）、阳性对照组（TNF-α：20ng/ml）、IL-27组（IL-27：20ng/ml）、TNF-α+IL-27组（即双细胞因子组，TNF-α：10ng/ml+IL-27：10ng/ml）。2.利用倒置显微镜，分别观察培养至第1d、3d、5d和7d各组未成熟及成熟DC的形态。3.通过磁珠分选的方法分离各组DC。4.通过流式细胞术检测各组DC表面共刺激分子CD1a、CD83和CD80、CD86以及细胞表面粘附分子ICAM-1的表达水平。5.通过RT-pCR的方法检测各组DC表面趋化因子受体CCR5、CCR7mRNA的表达情况。6.用MTS的方法检测各组DC经丝裂霉素C处理后，刺激同种异体T淋巴细胞增殖的能力。7.用ELISA的方法检测各组DC培养上清中细胞因子IL-12、IFN-γ的分泌水平。8.用Western-blot的方法检测各组DC信号通路蛋白MApKp38、p-stat1和p-stat3的含量。结果：1.光镜下，在培养至第5天时，各组细胞形态均一，呈集落状生长，体积较小且胞体较圆。培养至第7天时，IL-27组和TNF-α+IL-27组DC呈现典型的成熟形态学特征，胞体较大，细胞伸出伪足，表现出明显的毛刺样结构，与阳性对照TNF-α组相比无明显差别;而Negative组细胞胞体较小，表面毛刺状突起较少，无典型DC形态。2.流式细胞结果显示，外周血单个核细胞于体外诱导培养第7d时,Negative组、TNF-α组、IL-27组和TNF-α+IL-27组DC表面共刺激分子CD1a和CD83双阳性率分别为23.29±4.49%、42.76±3.50%、35.75±4.10%和52.49±2.65%，CD80和CD86双阳性率分别为22.66±3.20%、45.56±2.47%、39.06±1.61%和54.10±0.46%。其中IL-27组与TNF-α组相比CD1a和CD83、CD80和CD86的双阳性率均没有统计学意义（p＞0.05），而TNF-α+IL-27组的双阳性率显著高于TNF-α组和IL-27组，结果具有统计学意义（ppp＞0.05）。3. RT-pCR结果显示，Negative组、TNF-α组、IL-27组和TNF-α+IL-27组DC表面趋化因子受体CCR7mRNA的表达水平分别为3.09±0.18、4.14±0.08、3.98±0.09、4.75±0.11，其中TNF-α组、IL-27组和TNF-α+IL-27组CCR7mRNA的表达水平显著高于Negative组，统计学分析发现各组之间的比较均具有统计学意义（pppp＞0.05）。4. MTS结果显示，TNF-α组、

关键词：白细胞介素-27 树突状细胞共刺激分子粘附分子趋化因子受体 MApKp38 p-stat1 p-stat3

七味白术散对HRV感染乳鼠小肠iEL CD3+T细胞核中抗病毒蛋白表达的影响及清除肠道HRV作用

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七味白术散对HRV感染乳鼠小肠iEL CD3+T细胞核中抗病毒蛋白表达的...

作者：左胜男湖南中医药大学

学位级别：硕士

目的：探讨七味白术散对HRV感染乳鼠小肠iEL CD3++T细胞胞核中抗病毒蛋白表达的影响,进一步阐明该方抗HRV机理。方法：1.用HRV悬液,经口感染5日龄乳鼠,取乳鼠粪便经酶联免疫法(ELISA)证实轮状病毒抗原阳性后,建立乳鼠感染HRV腹泻模型。2... 详细信息

目的：探讨七味白术散对HRV感染乳鼠小肠iEL CD3++T细胞胞核中抗病毒蛋白表达的影响,进一步阐明该方抗HRV机理。方法：1.用HRV悬液,经口感染5日龄乳鼠,取乳鼠粪便经酶联免疫法(ELISA)证实轮状病毒抗原阳性后,建立乳鼠感染HRV腹泻模型。2.将感染HRV腹泻乳鼠随机分为模型组(MG)、七味白术散组(BG)、病毒唑组(ZG)、抑制剂组(YG)、七味白术散加抑制剂组(BYG),病毒唑加抑制剂组(ZYG),并设立正常对照组(NG),合共七组。各治疗组乳鼠分别经口滴入相应的药物50μl/(只·次)。正常对照组与模型组经口滴入等量细胞维持液。3.(1)分别于用药后15min、1h、2h、6h、12h、24h、32h、48h取乳鼠小肠粘膜,分离出CD3+T细胞,采用western blotting方法测定细胞质中p-JAK1、p-stat1的表达;(2)分别于用药后32h,40h,48h取乳鼠小肠粘膜,分离出CD3+T细胞,采用western blotting方法测定细胞核中pKRp-eIF 2α、OAS,RNaseL蛋白的表达;(3)药物治疗5天后取乳鼠粪便,梯度稀释后接种于MA104细胞培养,采用免疫荧光的方法观察细胞中阳性病毒颗粒,判断药物对肠道病毒的清除作用。结果：***乳鼠小肠粘膜iEL中CD3+T细胞质p-JAKl蛋白的表达增加,6h至12h到达高峰,611后表达量均高于同时间点MG、ZG、BYG、ZYG、YG(pp-stat1蛋白的表达明显高于同时间点的MG、NG、BYG、ZYG、YG(ppKR、p-eIF 2α、OAS、RNaseL蛋白表达随时间变化,32h后逐渐升高,40h到48h达到顶峰,48h后逐渐下降,且各时间点表达均高于同时间点NG,MG、YG、ZYG(pp>0.05)说明七味白术散对肠道HRV有良好的清除作用;同时BG HRV感染阳性病毒颗粒数明显低于YG、BYG、ZYG,差别有统计学意义(pstat1蛋白,促进细胞核中抗病毒蛋白(OAS、pKR)的表达,从而实现对HRV的清除作用。

关键词：七味白术散 HRV p-JAK1 p-stat1 pKR p-eIF 2α OAS RNaseL

肿瘤微环境酸化通过ASICs促进MDSCs免疫抑制功能及其机制的研究

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肿瘤微环境酸化通过ASICs促进MDSCs免疫抑制功能及其机制的研究

作者：伊萍中南民族大学

学位级别：硕士

髓源抑制细胞(myeloid-derived suppressors cells,MDSCs)是诱导肿瘤酸化微环境免疫抑制状态的重要细胞,往往导致肿瘤免疫治疗的失败。酸敏感离子通道(ASICs)是由H激活的门控阳离子通道,可以感知细胞内外H梯度的变化。本课题以小鼠来源... 详细信息

髓源抑制细胞(myeloid-derived suppressors cells,MDSCs)是诱导肿瘤酸化微环境免疫抑制状态的重要细胞,往往导致肿瘤免疫治疗的失败。酸敏感离子通道(ASICs)是由H激活的门控阳离子通道,可以感知细胞内外H梯度的变化。本课题以小鼠来源的MDSCs为研究对象,探讨肿瘤酸化微环境促进MDSCs活化是否与其表达ASICs有关,以及ASICs对MDSCs的功能影响机制,主要研究内容和结果如下:1.肿瘤微环境酸化对MDSCs功能的影响肿瘤微环境酸化可促进MDSCs分泌抑制性的细胞因子。当pH降低至5.5较正常来源对照,酸化环境明显促进MDSCs表达ROS,COX-2,TNF-?,ARG-1。预先用阿米洛利处理可以明显抑制酸化环境刺激MDSCs因子分泌,预先用ASIC1抑制剂pcTx1能够抑制荷瘤小鼠MDSCs TNF-α表达,ASIC3抑制剂ApET×2明显降低COX-2分泌,且两者均能减少ROS和ARG-1的产生。进一步研究发现预先加入pcTx1或ApET×2均能够逆转MDSCs对T细胞增殖的抑制作用,使T细胞增殖显著增加恢复到正常增殖水平。上述结果提示ASIC1和ASIC3在酸化环境刺激MDSCs活化过程中起到重要作用。2.肿瘤微环境酸化对MDSCs功能影响的分子机制2.1微环境酸化时荷瘤小鼠来源MDSCs p38磷酸化水平明显增高,且预先加入阿米洛利后,p38磷酸化水平显著降低,酸化环境能够刺激MDSCs NF-кB途径的p65活化,分别用阿米洛利、pcTx1、ApET×2预处理,发现pcTx1能够抑制p-p65,p-IкB,pIKK磷酸化,即抑制NF-кB信号通路活化,而ApET×2对该信号通路作用不明显,提示MDSCs在酸化环境中NF-кB途径被激活,且其激活过程与ASIC1密切相关。2.2微环境酸化时,荷瘤小鼠MDSCs stat1,stat6磷酸化水平增高,预先加入阿米洛利、pcTx1、ApET×2,发现pstat1,pstat6磷酸化水平显著下降,提示酸化条件可能通过刺激ASIC1,ASIC3,促发转录因子stat1,stat6磷酸化活化,进而介导MDSCs活化发挥免疫抑制作用。结论:(1)肿瘤酸化微环境促进MDSCs分泌ROS,COX2,TNF-α细胞因子,且pcTx1能够抑制荷瘤小鼠MDSCs TNF-α表达,ApET×2明显降低COX2分泌,且两者均能减少ROS和ARG-1的产生。同时,pcTx1,ApET×2能够逆转MDSCs对T细胞增殖的抑制作用。(2)在酸化环境中NF-кB途径被激活,且其激活过程与ASIC1密切相关。同时,酸化条件可能通过刺激ASIC1,ASIC3,促发转录因子stat1,stat6磷酸化活化,进而介导MDSCs活化发挥免疫抑制作用。

关键词：髓系来源细胞酸敏感离子通道 ROS p-p38 p-p65 p-stat1 pstat6

糖皮质激素对肿瘤细胞pD-L1表达的调控作用及机制研究

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糖皮质激素对肿瘤细胞PD-L1表达的调控作用及机制研究

作者：王婷婷浙江大学

学位级别：硕士

研究目的:程序性死亡受体-1(programmed death-1,pD-1)及其配体(programmed death ligand-1,pD-L1)结合后形成免疫抑制性微环境,在肿瘤免疫逃逸过程中发挥关键作用,多个基于阻断pD-1/pD-L1结合的单克隆抗体药物已被批准用于黑色素瘤、... 详细信息

研究目的:程序性死亡受体-1(programmed death-1,pD-1)及其配体(programmed death ligand-1,pD-L1)结合后形成免疫抑制性微环境,在肿瘤免疫逃逸过程中发挥关键作用,多个基于阻断pD-1/pD-L1结合的单克隆抗体药物已被批准用于黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾癌等恶性肿瘤的治疗。但这一类免疫检查点抑制剂在应用过程中会发生免疫相关不良反应(Immune-related adverse events,ir AEs),可累及机体各个器官和组织,病情严重时会危及生命。目前主要使用糖皮质激素来预防和减缓ir AEs的发生。糖皮质激素对免疫系统具有抑制作用,因此,糖皮质激素是否对免疫检查点抑制剂的治疗效果产生负性影响,是临床上极为关注的问题。有临床回顾性分析提示治疗剂量下糖皮质激素削弱了pD-1/pD-L1单抗对非小细胞肺癌的治疗效果,而在黑色素瘤中糖皮质激素对免疫治疗无显著影响。针对pD-1/pD-L1的免疫治疗发挥作用的前提是免疫抑制的形成,因此,肿瘤细胞pDL1的表达是决定其治疗效果的另一关键因素。目前未见文献报导糖皮质激素对肿瘤细胞pD-L1表达的影响。本研究旨在考察糖皮质激素对肿瘤细胞pD-L1表达的调控作用,从肿瘤细胞角度探究糖皮质激素对免疫治疗效果的潜在影响,为临床糖皮质激素的应用是否对免疫治疗产生不利影响提供实验依据。研究方法:采用人源非小细胞肺癌NCI-H292细胞和A549细胞、人源黑色素瘤A2058细胞和A375细胞及人源肾癌786-O细胞和769-p细胞作为细胞模型评价糖皮质激素对肿瘤细胞上pD-L1表达的调控作用。1)分别在基础水平和IFNγ诱导pD-L1上调模型中考察地塞米松对肿瘤细胞上pD-L1蛋白表达的影响;2)在NCI-H292上检测pD-L1蛋白表达随地塞米松作用时间的变化;3)在IFNγ诱导模型中考察浓度梯度的地塞米松对NCI-H292细胞和A549细胞上pD-L1蛋白水平的影响;4)采用流式细胞术考察地塞米松对非小细胞肺癌细胞表面蛋白CD274的影响;5)采用糖皮质激素作用于NCI-H292、A2058和786-O考察糖皮质激素对pD-L1的影响;6)通过蛋白合成抑制剂CHX(Cycloheximide,CHX)阻止细胞内蛋白的从头合成,并结合Western Blot检测地塞米松在基础水平和IFNγ诱导模型中对NCIH292细胞上pD-L1降解速率的影响,并对结果做统计分析;7)进而用蛋白酶体抑制剂MG132阻止pD-L1蛋白的泛素化降解,或用溶酶体抑制剂CQ抑制pD-L1蛋白的溶酶体途径降解,结合Western Blot检测地塞米松在基础水平和IFNγ诱导模型中对pD-L1蛋白的影响;8)在基础水平和IFNγ诱导模型中分别给予地塞米松,结合q-pCR考察地塞米松对pD-L1转录水平的影响。采用人源非小细胞肺癌NCI-H292细胞、人源黑色素瘤A2058细胞以及人源肾癌786-O细胞,探究糖皮质激素调控肿瘤细胞pD-L1表达的分子机制。1)收集肿瘤细胞裂解液检测肿瘤细胞上糖皮质激素受体的表达水平;2)通过q-pCR检测NCI-H292细胞上地塞米松、安息缩松和倍他米松对GR下游靶基因的激活情况;3)采用人源黑色素瘤A2058细胞以及人源肾癌786-O细胞,结合q-pCR检测地塞米松对GR下游靶基因的激活水平;4)检测pD-L1的经典上游调控蛋白IRF1的表达水平以及stat1的总蛋白水平及其磷酸化水平变化。在体外采用鼠源性肿瘤细胞考察糖皮质激素对pD-L1的调控作用,并通过体内实验初步考察糖皮质激素受体与pD-L1表达的相关性。1)在鼠源性结肠癌MC38细胞、鼠源性肺癌LLC细胞和鼠源性黑色素瘤B16细胞中通过Western Blot法检测不同浓度的地塞米松对pD-L1蛋白表达水平的影响;2)采用鼠源性结肠癌MC38细胞,在基础水平和IFNγ诱导模型中分别考察糖皮质激素对pD-L1的调控作用。3)采用MC38腋下接种模型和LLC移植瘤模型考察肿瘤细胞经过免疫监视后其GR和pD-L1表达水平的变化。研究结果:糖皮质激素能够显著抑制非小细胞肺癌细胞pD-L1的蛋白表达,但不影响肾癌细胞和黑色素瘤细胞pD-L1蛋白表达。Western Blot结果显示,在NCI-H292细胞上给予地塞米松可下调pD-L1的蛋白水平;在A549和NCI-H292的IFNγ诱导模型中,地塞米松显著抑制IFNγ引起的pD-L1蛋白的上调。为进一步明确地塞米松对pD-L1蛋白表达的抑制作用,我们考察地塞米松在非小细胞肺癌细胞上的时效关系和量效关系。结果显示,在IFNγ诱导模型中,地塞米松浓度依赖性下调pDL1的蛋白水平。随着地塞米松作用时间增加,pD-L1的蛋白水平逐渐降低。由于pD-

关键词： pD-L1 地塞米松 IFNγ p-stat1 IRF1