糖皮质激素对肿瘤细胞PD-L1表达的调控作用及机制研究

作     者：王婷婷 

作者单位：浙江大学 

学位级别：硕士

导师姓名：杨波;丁玲

授予年度：2020年

学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100706[医学-药理学] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：PD-L1 地塞米松 IFNγ p-STAT1 IRF1 

摘      要：研究目的:程序性死亡受体-1(Programmed death-1,PD-1)及其配体(Programmed death ligand-1,PD-L1)结合后形成免疫抑制性微环境,在肿瘤免疫逃逸过程中发挥关键作用,多个基于阻断PD-1/PD-L1结合的单克隆抗体药物已被批准用于黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾癌等恶性肿瘤的治疗。但这一类免疫检查点抑制剂在应用过程中会发生免疫相关不良反应(Immune-related adverse events,ir AEs),可累及机体各个器官和组织,病情严重时会危及生命。目前主要使用糖皮质激素来预防和减缓ir AEs的发生。糖皮质激素对免疫系统具有抑制作用,因此,糖皮质激素是否对免疫检查点抑制剂的治疗效果产生负性影响,是临床上极为关注的问题。有临床回顾性分析提示治疗剂量下糖皮质激素削弱了PD-1/PD-L1单抗对非小细胞肺癌的治疗效果,而在黑色素瘤中糖皮质激素对免疫治疗无显著影响。针对PD-1/PD-L1的免疫治疗发挥作用的前提是免疫抑制的形成,因此,肿瘤细胞PDL1的表达是决定其治疗效果的另一关键因素。目前未见文献报导糖皮质激素对肿瘤细胞PD-L1表达的影响。本研究旨在考察糖皮质激素对肿瘤细胞PD-L1表达的调控作用,从肿瘤细胞角度探究糖皮质激素对免疫治疗效果的潜在影响,为临床糖皮质激素的应用是否对免疫治疗产生不利影响提供实验依据。研究方法:采用人源非小细胞肺癌NCI-H292细胞和A549细胞、人源黑色素瘤A2058细胞和A375细胞及人源肾癌786-O细胞和769-P细胞作为细胞模型评价糖皮质激素对肿瘤细胞上PD-L1表达的调控作用。1)分别在基础水平和IFNγ诱导PD-L1上调模型中考察地塞米松对肿瘤细胞上PD-L1蛋白表达的影响;2)在NCI-H292上检测PD-L1蛋白表达随地塞米松作用时间的变化;3)在IFNγ诱导模型中考察浓度梯度的地塞米松对NCI-H292细胞和A549细胞上PD-L1蛋白水平的影响;4)采用流式细胞术考察地塞米松对非小细胞肺癌细胞表面蛋白CD274的影响;5)采用糖皮质激素作用于NCI-H292、A2058和786-O考察糖皮质激素对PD-L1的影响;6)通过蛋白合成抑制剂CHX(Cycloheximide,CHX)阻止细胞内蛋白的从头合成,并结合Western Blot检测地塞米松在基础水平和IFNγ诱导模型中对NCIH292细胞上PD-L1降解速率的影响,并对结果做统计分析;7)进而用蛋白酶体抑制剂MG132阻止PD-L1蛋白的泛素化降解,或用溶酶体抑制剂CQ抑制PD-L1蛋白的溶酶体途径降解,结合Western Blot检测地塞米松在基础水平和IFNγ诱导模型中对PD-L1蛋白的影响;8)在基础水平和IFNγ诱导模型中分别给予地塞米松,结合q-PCR考察地塞米松对PD-L1转录水平的影响。采用人源非小细胞肺癌NCI-H292细胞、人源黑色素瘤A2058细胞以及人源肾癌786-O细胞,探究糖皮质激素调控肿瘤细胞PD-L1表达的分子机制。1)收集肿瘤细胞裂解液检测肿瘤细胞上糖皮质激素受体的表达水平;2)通过q-PCR检测NCI-H292细胞上地塞米松、安息缩松和倍他米松对GR下游靶基因的激活情况;3)采用人源黑色素瘤A2058细胞以及人源肾癌786-O细胞,结合q-PCR检测地塞米松对GR下游靶基因的激活水平;4)检测PD-L1的经典上游调控蛋白IRF1的表达水平以及Stat1的总蛋白水平及其磷酸化水平变化。在体外采用鼠源性肿瘤细胞考察糖皮质激素对PD-L1的调控作用,并通过体内实验初步考察糖皮质激素受体与PD-L1表达的相关性。1)在鼠源性结肠癌MC38细胞、鼠源性肺癌LLC细胞和鼠源性黑色素瘤B16细胞中通过Western Blot法检测不同浓度的地塞米松对PD-L1蛋白表达水平的影响;2)采用鼠源性结肠癌MC38细胞,在基础水平和IFNγ诱导模型中分别考察糖皮质激素对PD-L1的调控作用。3)采用MC38腋下接种模型和LLC移植瘤模型考察肿瘤细胞经过免疫监视后其GR和PD-L1表达水平的变化。研究结果:糖皮质激素能够显著抑制非小细胞肺癌细胞PD-L1的蛋白表达,但不影响肾癌细胞和黑色素瘤细胞PD-L1蛋白表达。Western Blot结果显示,在NCI-H292细胞上给予地塞米松可下调PD-L1的蛋白水平;在A549和NCI-H292的IFNγ诱导模型中,地塞米松显著抑制IFNγ引起的PD-L1蛋白的上调。为进一步明确地塞米松对PD-L1蛋白表达的抑制作用,我们考察地塞米松在非小细胞肺癌细胞上的时效关系和量效关系。结果显示,在IFNγ诱导模型中,地塞米松浓度依赖性下调PDL1的蛋白水平。随着地塞米松作用时间增加,PD-L1的蛋白水平逐渐降低。由于PD-