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irf1与IFN-β协同调节M1巨噬细胞极化及其抗肿瘤效应

第十一届全国免疫学学术大会

作者： Gu Guangxiang Department of Liver Surgery Renji Hospital Shanghai Jiaotong University School of Medicine

Type 1 regulatory T cells(Tr1 cells)are IL-27 induced IL-10 producing cells that are crucial for control of autoimmunity and resolution of *** we show that IL-27 induces Interferon Regulatory Factor 1(irf1)and BATF,a member of the AP1 family,both of which are critical for differentiation of Tr1 cells and for their suppressive functions in vitro and in *** T cell activation and addition of IL-27,both irf1 and BATF bind to the

关键词： TR1 BATF irf1

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IRF1与IFN-β协同调节M1巨噬细胞极化及其抗肿瘤效应

作者：谢昌利重庆医科大学

学位级别：硕士

目的:初步探讨irf1与IFN-β协同调节M1巨噬细胞极化的机制及其抗肿瘤效应。方法:用PMA,IFN-γ及LPS将U937单核系肿瘤细胞诱导成经典极化的巨噬细胞(M1),流式细胞术检测M1/M2表面标志物CD86及CD206,荧光定量PCR及ELISA分别检测M1/M2相关... 详细信息

目的:初步探讨irf1与IFN-β协同调节M1巨噬细胞极化的机制及其抗肿瘤效应。方法:用PMA,IFN-γ及LPS将U937单核系肿瘤细胞诱导成经典极化的巨噬细胞(M1),流式细胞术检测M1/M2表面标志物CD86及CD206,荧光定量PCR及ELISA分别检测M1/M2相关细胞因子:IL-12p35、IL-12p40、IL-12p70、IL-23p19、IL-6、TNF-α及IL-10。用中和性单抗及siRNA-IFNB1/siirf1两种方法将IFN-β中和,或IFNB1或irf1干扰后,检测內源性IFN-β以及irf1对M1巨噬细胞极化的影响,同时荧光定量PCR,Western blot及ELISA检测irf1、IFN-β和irf5的表达情况。以条件培养基(CM)分别培养肝癌细胞系SMCC-7721和HepG2,用CCK8检测肝癌细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,Transwell实验检测肝癌细胞侵袭。结果:用U937构建的M1巨噬细胞模型高表达M1相关标志物IL-12p35、IL-12p40、IL-12p70、IL-23p19、IL-6、TNF-α和CD86(Pirf1或IFN-β的作用后,与对照组相比,M1相关标志物IL-12p35、IL-12p40、IL-12p70、IL-23p19、IL-6、TNF-α和CD86表达降低(P10表达升高(Pirf1后,IFN-β和irf5表达降低;阻断IFN-β后,irf1和irf5表达降低。用阻断irf1和IFN-β后的条件培养基(CM-siIFNB1或CM-Ab)培养SMCC-7721和HepG2后,与对照组相比,肝癌细胞的增殖能力和侵袭能力增强,细胞凋亡降低(P1巨噬细胞模型中,irf1和IFN-β相互调节,且二者可能共同调节irf5的表达,进一步促进M1巨噬细胞极化及其抗肿瘤效应。

关键词： M1巨噬细胞极化 irf1 IFN-β irf5 抗肿瘤效应

irf1/Klotho在多发性肌炎和肺动脉高压中的差异表达及作用探讨

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IRF1/Klotho在多发性肌炎和肺动脉高压中的差异表达及作用探讨

作者：覃林莽华南理工大学

学位级别：硕士

背景:多发性肌炎(PM)和肺动脉高压(PAH)是风湿免疫科中的常见病,针对多发性肌炎和肺动脉高压目前临床治疗效果的有限,治疗方式前者多为使用激素和免疫抑制剂,而后者主要为扩血管药物的对症治疗,患者预后不佳导致生活质量难以改善。截止... 详细信息

背景:多发性肌炎(PM)和肺动脉高压(PAH)是风湿免疫科中的常见病,针对多发性肌炎和肺动脉高压目前临床治疗效果的有限,治疗方式前者多为使用激素和免疫抑制剂,而后者主要为扩血管药物的对症治疗,患者预后不佳导致生活质量难以改善。截止目前,这两种疾病具体的发病机制仍不清楚。近年来学界的研究表明Ⅰ型干扰素(IFN-Ⅰ)信号通路在肌炎中的重要性,我们研究发现干扰素调节因子1(irf1)具有调控Ⅰ型干扰素和Klotho表达的双重作用,Klotho是一个在调节肌肉生长发育和细胞间质转化中起重要作用的多功能蛋白,经过初步研究,可以大胆猜测,irf1及其调控的Klotho极有可能在多发性肌炎和肺动脉高压中发挥着重要作用。因此,本文旨在研究irf1及Klotho在多发性肌炎中的差异表达,及探讨在肺动脉高压中的作用,为多发性肌炎和肺动脉高压的诊疗提供新的思路。目的:研究irf1和Klotho在多发性肌炎中的差异表达,以及研究在肺动脉高压中的差异表达及作用。方法:1.利用生物信息学方法分析多发性肌炎的差异表达基因,并通过组织学染色、免疫组化、q PCR、WB、ELISA和免疫荧光等实验手段对多发性肌炎患者的标本进行验证。2.通过构建肺动脉高压大鼠模型,和收集临床肺动脉高压患者的外周血,ELISA法检测肺动脉高压大鼠及患者外周血血清中irf1和Klotho的表达水平;在体内,免疫荧光法检测Klotho与内皮间质转化的相关性;在体外,培养原代大鼠肺动脉内皮细胞进行细胞实验,通过对irf1基因进行正反双向表达操作及过表达Klotho质粒,观察irf与Klotho的调控关系,以及Klotho对内皮间质转化的调控作用;利用JAK抑制剂干预细胞,观察TGF-β1刺激动脉内皮细胞后,内皮间质转化相关蛋白、磷酸化Smad3和Klotho蛋白的表达水平,以及对细胞功能的影响。结果:1.在公开数据库中,筛选到irf1在多发性肌炎中表达升高,并且在多发性肌炎患者的临床标本中证明了irf1表达升高和Klotho表达下降;2.肺动脉高压大鼠和肺动脉高压患者的外周血血清中irf1表达升高,Klotho表达下降;在体内,与对照组相比,肺动脉高压大鼠模型肺组织中α-SMA荧光强度增加,CD31和Klotho荧光强度下降且共表达于内皮细胞中;在体外,敲降irf1引起Klotho表达增加,irf1表达增加引起Klotho表达下降;Klotho可下调肺动脉内皮细胞Fibronectin和α-SMA蛋白的表达,上调VE-Cadherin和CD31蛋白的表达;使用JAK抑制剂可引起Klotho表达升高,而高表达Klotho抑制TGF-β1诱导的肺动脉内皮细胞间质转化,抑制细胞的迁移和侵袭能力。结论:1.在多发性肌炎中,irf1表达水平升高和Klotho表达水平降低。***1负向调控Klotho促进内皮间质转化,JAK抑制剂可抑制内皮间质转化,可能改善肺动脉高压。

关键词： irf1 Klotho 多发性肌炎肺动脉高压

irf1介导中间态细胞调控鼻息肉上皮细胞的分化作用

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IRF1介导中间态细胞调控鼻息肉上皮细胞的分化作用

作者：于鹏翼青岛大学

学位级别：硕士

研究目的:慢性鼻-鼻窦炎伴鼻息肉(Chronic Rhinosinusitis with Nasal Polyps,CRSwNP)是一种伴有鼻塞、嗅觉减退、头痛等症状的鼻-鼻窦黏膜炎症性疾病,其发病机制复杂、术后复发率高且与下气道炎症的联系大,已造成患者严重的心理、经济... 详细信息

研究目的:慢性鼻-鼻窦炎伴鼻息肉(Chronic Rhinosinusitis with Nasal Polyps,CRSwNP)是一种伴有鼻塞、嗅觉减退、头痛等症状的鼻-鼻窦黏膜炎症性疾病,其发病机制复杂、术后复发率高且与下气道炎症的联系大,已造成患者严重的心理、经济负担。上皮细胞(Epithelial Cells,EC)的异常分化促进CRSwNP的发生和发展;然而,具体机制尚不清楚。我们拟构建一个来自CRSwNP患者鼻灌洗液细胞的单细胞图谱,描绘其EC的分化轨迹,并探讨异常EC分化在鼻息肉发病机制中的作用。研究方法:1.从3名CRSwNP患者和3名对照受试者的鼻腔灌洗液中分离出单细胞悬液作为实验样本。2.利用单细胞RNA测序(10×Genomics)测序技术对单细胞悬液样本进行捕获和测序。3.对测序数据进行质控、筛选,获得符合单细胞要求的高质量数据进行降维、聚类及可视化等常规分析。4.利用各细胞亚群差异标志基因对各细胞类型及EC亚群进行识别、鉴定和分群。5.通过基于一种细胞类型的受体表达和另一种细胞的相应配体表达而得出的受体-配体相互作用进行细胞间通讯分析。6.利用拟时序分析推断细胞亚群的分化先后顺序,并通过分支表达式分析建模(Branched Expression Analysis Modeling,BEAM)函数描绘各亚群中差异基因的分布差异情况。7.基因本体(Gene Ontology,GO)分析及京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encylopaedia of Genes and Genomes,KEGG)分析将各亚群细胞的差异基因与功能列表进行对应,探索各亚群及其差异基因的功能差异。8.单细胞调节网络推理和聚类(Single-cell Regulatory Network Inference and Clustering,SCENIC)分析通过计算靶基因的基因调控网络模块(regulon)的受试者工作特征曲线(Receiver Operating Characteristic Curve,ROC)下面积(Area Under Curve,AUC)值,评估转录因子的激活情况。9.探讨EC分化过程中基因表达的差异,使用蛋白质组学分析、免疫荧光和流式细胞术进行验证。研究结果:1.通过单细胞RNA测序,对6个样本的鼻灌洗液中29,393个合格单细胞进行数据分析。2.在数据质控、筛选、降维、可视化后,进行标志基因的比对,鉴定出多种EC和免疫细胞亚群,并重新鉴定出11种EC亚群。3.在每个EC亚群中,CRSwNP组和对照组之间均筛选出超过140个差异表达基因(Differentially Expressed Gene,DEG);其中,半胱氨酸蛋白酶抑制剂1(Cystatin SN,CST1)和凝溶胶蛋白(Gelsolin,GSN)在所有EC亚群中均呈上调趋势,因此被称为核心DEG。4.拟时序分析描绘出鼻灌洗液中EC的分化轨迹,EC的异常分化轨迹最初出现在CRSwNP组的MUC5ACFOXJ1细胞亚群(中间态细胞)中,免疫荧光染色及流式细胞分析均证实鼻粘膜组织中存在中态间细胞。5.中间态细胞状态的出现与转录因子干扰素调节因子1(Interferon Regulatory Factor 1,irf1)的低表达密切相关。流式细胞分析显示,与对照组相比,CRSwNP组鼻灌洗液中irf1中间态细胞的比例显著降低。***组中,富集于拟时序树短分支的FOXJ1PIFOPOS1ECRG4纤毛细胞(纤毛细胞2)中也表现出irf1的降低。irf1通过靶向CRSwNP中的下游信号分子(IFI6、GBP1、PSMB8、PSMB9和RARRES3)来控制中间态细胞到纤毛细胞2的异常分化。结论:irf1作为核心转录因子不仅参与CRSwNP患者中间态细胞的异常分化,还在随后的异常纤毛细胞分化中发挥持续的调节作用。从irf1中间态细胞向irf1纤毛细胞2的分化过程直接导致EC的功能障碍,并进一步促进CRSwNP的发生和发展,这有助于开发治疗CRSwNP的新策略。

关键词：慢性鼻-鼻窦炎伴鼻息肉单细胞测序技术上皮细胞分化轨迹 irf1

irf1抑制大肠癌增殖转移及其分子机制的初步探讨

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IRF1抑制大肠癌增殖转移及其分子机制的初步探讨

作者：洪敏南方医科大学

学位级别：硕士

研究背景和目的结直肠癌是最常见的恶性肿瘤之一,随着环境因素、饮食习惯、生活方式等因素的改变,结直肠癌的发病率呈逐渐升高的趋势。有无转移对结直肠癌患者的治疗效果及生存率有重要影响,因此阐明结直肠癌转移相关的分子机制及寻找... 详细信息

研究背景和目的结直肠癌是最常见的恶性肿瘤之一,随着环境因素、饮食习惯、生活方式等因素的改变,结直肠癌的发病率呈逐渐升高的趋势。有无转移对结直肠癌患者的治疗效果及生存率有重要影响,因此阐明结直肠癌转移相关的分子机制及寻找临床治疗的有效靶点是目前结直肠癌研究的重要内容。转录因子（transcription factor）是能与位于转录起始位点上游50～5000bp的顺式作用元件、沉默子或增强子结合并参与调节靶基因转录效率的一组蛋白,并能将来自细胞表面的信息传递至核内基因。转录因子通常有几个功能域,可分为DNA结合域、转录调控域及自身活性调控域,DNA结合域可与特定的DNA序列（一般长8～20bp）相互作用,使转录因子与靶基因结合起来,随之转录调控域就可发挥其激活或抑制作用,通常这些结构域在结构与功能上是独立分开的。不同的转录因子还可结合于紧密相邻的DNA序列而形成一种多聚体结构来调节基因表达,这种组合调控不论转录因子是否激活及其含量多少均可激活基于靶基因中特定转录因子结合位点的转录。除启动基础转录活性外,转录因子还能整合从细胞表面经信号转导途径传递而来的信号。irf1（interferon regulatory factor1）即干扰素调节因子1,在人体内是由irf1基因编码的,是一个转录因子,也是干扰素调节因子家族第一个被定义的成员。最初认为irf1是一个能激活β-IFN表达的转录因子,随后又证实irf1对它的靶基因有转录激活和转录抑制两方面的作用。irf1通过与其靶基因启动子区域的干扰素刺激反应原件（ISRE）相结合来实现对靶基因表达水平的调节,并且irf1是通过DNA结合结构域的N-末端的螺旋转角螺旋结构与ISRE相结合的,这个DNA结合结构域在所有的irf家族成员中都高度保守。irf1除了具有转录因子的功能之外,它也可以与其辅助因子p300结合进而反式激活肿瘤抑制因子p53而发挥作用。irf1在调节免疫应答、细胞坏死、DNA损伤应答以及抑制肿瘤的方面也发挥着重要作用。作为一个转录因子,它的功能与其靶基因密切相关,文献报道,RASSF5是经Chip-chip筛选的irf1调节靶基因,但未经实验证实。RASSF5（Ras association domain-containing protein 5）即 RAS 相关结构蛋白 5,目前研究普遍认为RASSF5是一个抑癌因子,它可以通过抑制ERK信号通路的活性从而抑制肿瘤细胞的增殖,而在肺癌中又可以促进细胞的凋亡。而RASSF5是通过酵母双杂交实验发现的一个新的RAS效应器,RAS活化时可以抵抗凋亡、增加细胞侵袭等作用,但是活化的RAS也可以与其效应蛋白结合从而发挥诱导细胞衰老、分化、细胞周期阻滞和凋亡等作用。目前,研究已证实irf1在乳腺癌、胃癌、食管癌、肾癌等恶性肿瘤中可能发挥了抑制肿瘤增殖、促进肿瘤细胞凋亡、增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性等作用,但irf1与结直肠癌之间的关系却鲜有报道。因此,本研究旨在探讨irf1对结直肠癌的增殖和转移的影响及其作用机制,为结直肠癌生长、转移机制提供实验依据。研究方法***1在结直肠癌组织及细胞中的表达采用荧光定量RT-PCR的方法检测了 39例结直肠癌新鲜组织标本及其配对的正常组织中irf1的表达并且检测了 irf1在HCT116、HT29、SW480、SW620、Lovo、LS174T6株结直肠癌细胞株中的表达。同时,运用Western blotting检测了 7例结直肠癌组织标本与其配对正常组织和上述6株结直肠癌细胞株中irf1的表达。***1对结直肠癌细胞体外生物学特性的影响（1）使用PubMed查找irf1的基本信息,明确目的序列,通过PCR扩增出irf1的CDS区,随后通过酶切、纯化、连接、转化等步骤将irf1 CDS区连接进入质粒载体pcDNA3.0经测序证明重组载体载体构建成功,随后将其转染至SW480和SW620细胞中,通过G418筛选2周后利用RT-PCR和Western blotting验证SW480和SW620细胞中irf1的表达水平,建立稳定过表达irf1的SW480和SW620细胞亚系。同时,购买干扰irf1的shRNA,将其转染至HT29和LS174T细胞中,通过荧光显微镜观察转染效率后利用Western blotting验证HT29和LS174T细胞中irf1的表达水平,建立瞬时干扰irf1的HT29和LS174T细胞亚系。（2）过表达irf1之后,通过CCK8细胞增殖实验、平板克隆形成实验、Transwell迁移实验、流式细胞仪检测细胞周期及凋亡实验,验证irf1在体外对结直肠癌细胞增殖、克隆形成能力、迁移能力的影响。瞬时干扰irf1后通过CCK8细胞增殖实验、Transwell迁移实验、流式细胞仪

关键词： irf1 结直肠癌转录因子增殖转移

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鸡irf1激活β干扰素和抗病毒作用的研究

鸡IRF1激活β干扰素和抗病毒作用的研究

作者：刘云霞上海交通大学

学位级别：硕士

干扰素调节因子(Interferon regulatory factors,irfs)是一类在干扰素(Interferon,IFN)信号通路中起重要调控作用的多功能转录因子。在哺乳动物中,irf1、irf3和irf7是激活调控IFN的主要irf亚型,其中,irf3被证实是最主要的调控因子。然而... 详细信息

干扰素调节因子(Interferon regulatory factors,irfs)是一类在干扰素(Interferon,IFN)信号通路中起重要调控作用的多功能转录因子。在哺乳动物中,irf1、irf3和irf7是激活调控IFN的主要irf亚型,其中,irf3被证实是最主要的调控因子。然而,鸡天然缺失irf3,这使得鸡IFN调控机制更为复杂。本课题组前期研究发现,鸡虽然缺失irf3,但鸡irf7能部分替代irf3参与干扰素刺激因子(Stimulator of Interferon Genes,STING)介导的IFN调控过程。作为在哺乳动物中另一重要的IFN调节因子,在irf3缺失的鸡细胞中,鸡irf1(chirf1)是否具备IFN调控作用?chirf1在IFN调控过程中与irf7是否存在相互促进或制约关系?是本研究拟解决的两个科学问题。为确定chirf1在irf3缺失的鸡细胞DF-1中的功能,本研究首先克隆了chirf1基因,序列分析发现该基因DNA结合域在进化中较保守。通过双报告及q PCR检测发现过表达chirf1能显著激活IFN-β启动子、上调IFN-β和IFN激活基因(IFN-stimulated genes,ISGs)的mRNA水平。通过缺失chirf1不同功能域,发现其转录抑制区、DNA结合区、核酸定位区及转录激活区在激活IFN-β中缺一不可。缺失IFN-β启动子上不同预测结合位点,发现chirf1主要与IFN-β启动子的第三个干扰素调节因子结合位点结合。以上结果表明chirf1参与鸡IFN-β表达调控。通过q PCR检测发现chirf1在健康鸡的脾脏等免疫器官中的表达量较高,且AIV或NDV感染的鸡的各组织中chirf1及IFN-β的mRNA均上调,暗示chirf1参与抗病毒天然免疫反应。体外细胞实验发现,chirf1过表达能有效抑制AIV及NDV在DF-1细胞中的增殖。为了进一步确认chirf1参与抗病毒免疫反应,利用CRISPR/Cas9技术成功构建了chirf1缺失的DF-1细胞系,病毒增殖实验发现,NDV和AIV在chirf1缺失的DF-1细胞中增殖能力明显增强。以上结果表明chirf1作为重要的IFN-β调控分子参与了抗病毒免疫应答。基因共表达发现,野生型DF-1细胞中chirf1并不能有效增强STING介导的IFN-β激活作用。然而,在irf7缺失细胞系中,chirf1可显著增强STING激活IFN-β的能力,同时chirf1对IFN-β的激活也较野生型DF-1中提高10倍以上。在irf7缺失细胞系中共表达chirf1和不同剂量的irf7,Western Blot显示随着irf7蛋白表达量的增加,chirf1蛋白量逐渐减少。推测irf7可能通过抑制chirf1的表达或以某种方式降解了chirf1蛋白,从而影响了chirf1参与STING介导的IFN-β激活调控过程。综上,本研究表明chirf1可参与IFN-β激活调控,并在抗病毒天然免疫中发挥重要作用,同时chirf1可与irf7相互协调参与STING介导的IFN-β的激活调控,这为进一步完善STING依赖的IFN-β信号通路的内涵奠定了研究基础。

关键词：鸡 irf1 IFN-β irf7 抗病毒天然免疫

鮸鱼（Miichthys miiuy）irf1的功能及调控研究

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鮸鱼（Miichthys miiuy）IRF1的功能及调控研究

作者：宣妹华浙江海洋大学

学位级别：硕士

干扰素调节因子(Interferon regulatory factors,irfs)是一种转录因子,能够调控干扰素(interferon,IFN)基因和干扰素刺激基因(IFN-stimulated genes,ISGs)的功能。irfs还能够结合启动子上游特殊的DNA序列,从而对目的基因表达的蛋白产生... 详细信息

干扰素调节因子(Interferon regulatory factors,irfs)是一种转录因子,能够调控干扰素(interferon,IFN)基因和干扰素刺激基因(IFN-stimulated genes,ISGs)的功能。irfs还能够结合启动子上游特殊的DNA序列,从而对目的基因表达的蛋白产生激活或者抑制的影响。irfs作为重要的转录因子,在IFN的转录调控、病原体的免疫反应、先天性免疫应答和细胞的分化、生长及凋亡等方面均起着至关重要的作用。迄今为止,已经鉴定出11个irfs:irf1RF11,其中irf4分为irf4a和irf4b两种亚型。irfs共分为irf1、irf3、irf4和irf5四个亚家族。Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)不仅是固有免疫系统识别病原相关分子模式的主要受体,并且由其启动的信号通路还能调控适应性免疫应答。TLRs信号通路主要分为两种:MyD88依赖的信号通路和非MyD88依赖的信号通路。由此可见,髓样分化因子(meyoid differentiation factor 88,MyD88)是TLRs信号通路中重要的接头分子,在传递上游信息和疾病的发生发展中具有重要的作用。MyD88可能对干扰素调节因子(irfs)有影响,但irfs对MyD88的调控机制尚不完全清楚。随着海水养殖规模的逐年扩大,养殖种类和产量也是与日俱增。在水产养殖走向高速发展的同时,一系列的问题也随之出现。其中,危害最大的就是鱼类病害的频繁出现。只有提高养殖鱼类抵御病害侵袭的能力,选育出抗病优良品种才能确保水产养殖业的可持续发展。鮸鱼(Miichthys miiuy)是我国重要的海洋经济鱼类。为找出鮸鱼的免疫分子,对其免疫相关分子的研究颇为重要。在本研究中,我们证明了鮸鱼irf1亚家族家族成员irf1作为一种负调控因子,能通过促进MyD88的降解从而对MyD88介导的NF-κB报告基因的荧光活性产生抑制作用。本文主要研究了鮸鱼的irf1基因的调控功能,主要结论如下:(1)通过双荧光素酶报告基因实验,证实鮸鱼irf1对MyD88介导的报告基因的荧光活性有抑制作用,并且在敲降irf1后能够缓解这种抑制作用。(2)过表达irf1和敲降irf1的western blotting实验中,确定了鮸鱼的irf1对MyD88有调控作用——irf1能够抑制MyD88基因的表达或者是irf1能够促进MyD88蛋白的降解。(3)通过对蛋白降解途径的分析,明确了irf1能够促进MyD88蛋白的降解,并且该蛋白降解途径为泛素-蛋白酶体途径。(4)通过western blotting实验和双荧光素酶报告基因实验,irf1的DBD结构域是其主要的功能结构域,irf1功能的产生与该结构有着密不可分的联系。

关键词： irf1 MyD88 负调控鮸鱼

大黄鱼irf1、irf2和irf11的分子特征及功能研究

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大黄鱼IRF1、IRF2和IRF11的分子特征及功能研究

作者：陈小娟福建农林大学

学位级别：硕士

大黄鱼(Larimichthys crocea)是我国重要的海洋经济鱼类,也是我国产量最高的海水养殖鱼类。近年来随着大黄鱼养殖规模不断扩大和养殖环境的恶化,病毒性疾病和细菌性疾病频发,给大黄鱼造成了重大经济损失,病害问题已经成为制约大黄鱼养... 详细信息

大黄鱼(Larimichthys crocea)是我国重要的海洋经济鱼类,也是我国产量最高的海水养殖鱼类。近年来随着大黄鱼养殖规模不断扩大和养殖环境的恶化,病毒性疾病和细菌性疾病频发,给大黄鱼造成了重大经济损失,病害问题已经成为制约大黄鱼养殖业健康快速发展的瓶颈。因此,开展大黄鱼免疫功能基因的研究,将为其病害的免疫防治提供理论依据。干扰素调节因子(Interferon regulatory factor,irf)是一类调控干扰素基因表达的转录因子,参与机体的抗病毒免疫、细胞周期和细胞凋亡等生物学过程。本论文以大黄鱼为研究对象,解析大黄鱼irf1、irf2和irf11的分子特征,探究其在调控I型干扰素表达和抗病毒免疫过程中的功能。大黄鱼irf1、irf2和irf11的开放阅读框全长分别为900、957和795个核苷酸,分别编码299、318和264个氨基酸组成的蛋白质。大黄鱼irf1、irf2和irf11都属于irf1子家族,具有相似的结构特征,氨基端含有1个DNA识别结构域(DNA binding domain,DBD),在DBD结构域中具有6个保守的色氨酸;羧基端含有irf相关结构域(irf association domain,IAD)。同源比对及进化分析表明,大黄鱼irf1、irf2和irf11和其相应的同源基因聚成一枝,与鮸鱼亲缘关系最近,且与其他物种的氨基酸序列相似度较高,分别为33.84%-95.65%、48.15%-92.16%和47.94%-97.35%。大黄鱼irf1、irf2和irf11基因在所有检测的组织或器官中均有表达,Lc irf1和Lc irf2在血液中表达水平最高,而Lc irf11在肌肉和皮肤中表达水平最高,三种基因在脑中表达水平都很低。在poly(I:C)刺激后,头肾和鰓组织中,Lc irf1、Lc irf2和Lc irf11的表达水平于刺激后6 h达到最高,在头肾中分别是对照组的31.78倍、17.03倍和13.80倍,在鰓中分别是对照组的29.96倍、12.73倍和1.85倍;脾脏中,Lc irf1基因的表达水平也是在6 h达到最大,是对照组的5.21倍,Lc irf2和Lc irf11基因表达水平分别于刺激后3 h和48 h达到峰值,其中Lc irf2增加3.05和6.08倍,Lc irf11增加16.87和75.63倍。这些结果表明Lc irf1、Lc irf2和Lc irf11可能参与大黄鱼抗病毒免疫应答。构建了大黄鱼irf1、irf2和irf11真核表达载体,分别电转大黄鱼头肾细胞系(LYCK),结果显示,过表达Lc irf1和Lc irf2蛋白均能够诱导Lc IFNd和Lc IFNh基因的表达,且过表达Lc irf2蛋白显著下调Lc IFNc基因的表达;过表达Lc irf11蛋白能够诱导Lc IFNc、Lc IFNd和Lc IFNh基因的表达。荧光素酶报告基因实验也取得了类似的结果,大黄鱼irf1和irf2能够增强Lc IFNd和Lc IFNh基因启动子的转录活性,且Lc irf2能够下调Lc IFNc启动子的活性。Lc irf11能够上调Lc IFNc、Lc IFNd和Lc IFNh基因启动子的转录活性。重组Lc IFNc、Lc IFNd及Lc IFNh均可促进大黄鱼头肾细胞(HKLs)中Lc irf1、Lc irf2和Lc irf11表达,但Lc irf2在Lc IFNh刺激6h时显著下调,Lc irf11在Lc IFNc及Lc IFNh刺激6h和Lc IFNd刺激12h时也显著下调。抗病毒实验结果显示,大黄鱼irf1、irf2和irf11过表达均显著抑制SVCV病毒的糖蛋白(Glycoprotein,G)、基质蛋白(Matrix protein,M)和磷酸蛋白(Phosphoprotein,P)基因转录,病毒滴度分别下降了10000倍、316228倍和38459倍。这些结果表明,大黄鱼irf1、irf2和irf11通过调节Lc IFNc、Lc IFNd和Lc IFNh基因的表达,增强大黄鱼的抗病毒免疫反应。

关键词：大黄鱼干扰素调节因子 irf1 irf2 irf11 抗病毒

长链非编码RNA irf1-AS在宿主细胞中抑制小反刍兽疫病毒复制的机制研究

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长链非编码RNA IRF1-AS在宿主细胞中抑制小反刍兽疫病毒复制的机...

作者：吕岱玥西北农林科技大学

学位级别：硕士

小反刍兽疫(PPR)是由小反刍兽疫病毒(PPRV)感染引起的一种急性、烈性、高度接触性传染病,主要感染山羊、绵羊以及其他野生小反刍兽,是长期困扰养殖业的重要疫病,也是世界动物卫生组织(Office international desépizooties,OIE)法定报... 详细信息

小反刍兽疫(PPR)是由小反刍兽疫病毒(PPRV)感染引起的一种急性、烈性、高度接触性传染病,主要感染山羊、绵羊以及其他野生小反刍兽,是长期困扰养殖业的重要疫病,也是世界动物卫生组织(Office international desépizooties,OIE)法定报告的动物疫病。研究表明,PPRV感染可以造成宿主严重的免疫抑制来促进自身增殖,但宿主是如何增强先天免疫从而抑制病毒的复制,鲜有人报道。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是人和动物细胞内一类长度超过200个核苷酸且不具有蛋白质编码能力或者编码能力有限的RNA分子,能通过多种机制调控病毒感染,但有关lncRNA在PPRV感染中的作用还不清楚。Ⅰ型干扰素及其所诱导的干扰素刺激基因(ISGs)作为先天免疫的重要组成部分,是机体抵御病毒感染的关键免疫分子。本实验室前期研究发现,宿主细胞感染PPRV后胞内有大量lncRNA差异表达,其中与先天免疫密切相关的长链非编码RNA irf1-AS显著上调。为揭示lncRNAirf1-AS通过影响细胞抗病毒天然免疫反应调控PPRV复制机制,开展了相关研究,研究结果如下:(1)EECs感染PPRV后,IFN-β及ISGs表达量与病毒的感染剂量及感染时间呈现正相关。当PPRV以不同感染剂量(MOI=0.5、3、10)感染山羊子宫内膜上皮细胞(Caprine endometrial epithelial cells,EECs)时,随着病毒N蛋白的表达量的增加,IFN-β及ISGs的m RNA水平也逐渐增加,其中MOI=3时变化最大;随着感染时间的延长PPRV N蛋白的表达量逐渐升高,同时IFN-β和ISGs的表达水平也呈现上升趋势,并在48 hpi达到峰值。重要的是,qRT-PCR的结果显示,PPRV感染EECs后的48 h,长链非编码RNA irf1-AS的表达开始逐渐上升。(2)干扰irf1-AS表达促进PPRV复制,过表达irf1-AS显著抑制病毒复制。为明确irf1-AS对PPRV复制的影响,设计合成两条不同的si RNA干扰irf1-AS表达。qRT-PCR的检测结果显示,两条si RNA均有显著的干扰效果。Western blot及TCID检测结果表明:当干扰irf1-AS表达后,与干扰对照组相比,病毒N蛋白的表达水平显著增加,病毒滴度也显著提高,这表明干扰irf1-AS表达促进病毒复制。另外,将irf1-AS构建至过表达载体中并转染细胞。qRT-PCR的检测结果显示,转染过表达载体后,irf1-AS表达显著提高。Western blot及TCID检测结果表明,与对照组相比,过表达组病毒N蛋白的表达水平和病毒滴度均显著下降。这表明过表达irf1-AS抑制病毒的复制。以上结果表明,irf1-AS在PPRV复制的过程中发挥重要作用。(3)irf1-AS能增强先天性免疫反应,抑制PPRV在细胞中的复制。为从先天性免疫反应的角度探究irf1-AS调控病毒复制的机制,干扰irf1-AS表达后,检测IFN-β及ISGs表达水平。结果显示,干扰irf1-AS表达能显著降低IFN-β及ISGs的表达水平,同时抑制Ⅰ型IFN关键信号通路转导分子irf3的磷酸化;与之相对应,当在PPRV感染的细胞中过表达irf1-AS时,irf1-AS的过表达能显著提高IFN-β及ISGs的表达水平,同时促进irf3的磷酸化。以上结果表明,irf1-AS在PPRV感染过程中能显著增强先天免疫反应从而抑制病毒复制。(4)irf1-AS通过上调irf1的表达,调控IFN-β和ISGs的表达以及irf3的磷酸化,影响病毒复制。为探索irf1-AS调控机体先天免疫的机制,对irf1-AS在基因组中位置特点进行分析,发现irf1可以成为irf1-AS顺式调控的靶基因。Western blot和qRT-PCR试验结果表明,PPRV感染细胞后,irf1的m RNA和蛋白质表达水平均出现上调,这与irf1-AS在PPRV感染过程中的表达趋势一致。实验结果也发现,过表达irf1-AS能促进irf1的表达,而干扰irf1-AS能抑制irf1的表达。这表明irf1-AS可以靶向调控irf1的表达。此外,干扰irf1表达不仅能降低IFN-β和ISGs的表达水平以及irf3的磷酸化,还能促进病毒的增殖。重要的是,实验结果表明irf1-AS可以通过调控irf1的表达来调控IFN-β和ISGs的表达以及irf3的磷酸化,并影响病毒复制。此外,本研究还证明了在PPRV感染过程中irf1蛋白和irf3蛋白的相互作用。综上所述,本研究发现EECs感染PPRV后先天免疫反应被激活,机体通过上调宿主源长链非编码RNA irf1-AS促进irf1蛋白的表达,进而促进Ⅰ型

关键词： PPRV lncRNA irf1-AS 先天性免疫反应 irf1

模式识别受体cGAS、cGASL及干扰素调控因子irf1、irf2、irf8在黄颡鱼天然免疫中的作用

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模式识别受体cGAS、cGASL及干扰素调控因子IRF1、IRF2、IRF8在黄...

作者：宋晶晶湖北大学

学位级别：硕士

模式识别受体介导的免疫识别是免疫应答的起始阶段,对“自己”和“异己”的有效识别和响应是天然免疫防御的基础和关键。环磷酸鸟苷-腺苷合成酶（cyclicGMP-AMP synthase,cGAS）是一种重要的模式识别受体,能识别特殊的“异己”成分——D... 详细信息

模式识别受体介导的免疫识别是免疫应答的起始阶段,对“自己”和“异己”的有效识别和响应是天然免疫防御的基础和关键。环磷酸鸟苷-腺苷合成酶（cyclicGMP-AMP synthase,cGAS）是一种重要的模式识别受体,能识别特殊的“异己”成分——DNA,进而启动信号级联反应,诱导I型干扰素和促炎性细胞因子的表达,产生天然免疫和适应性免疫应答。干扰素调控因子（interferon regulatory factor,irf）是一类能调控干扰素（interferon,IFN）基因表达的多功能转录因子,在天然免疫、血细胞发育,免疫系统的发育和调节过程中发挥重要作用。鱼类作为最低等的脊椎动物,其天然免疫识别和应答模式与哺乳动物有一定的相似性,也具有自身的独特性。对鱼类cGAS和irf基因的深入研究能拓展人们对脊椎动物cGAS信号通路和干扰素调控机制的认识,并为鱼类病害的免疫防控提供参考。我们从重要经济鱼类黄颡鱼中鉴定了两个cGAS基因,包括与哺乳类具有直向同源进化关系的cGAS基因和低等脊椎动物所特有的cGAS-like（cGASL）基因。本文围绕二者的表达模式、亚细胞定位、对干扰素的诱导激活及抗病效应开展了一系列研究。同时,在前期鉴定黄颡鱼irf家族基因的基础上,本文对irf1、irf2和irf8在鱼类抗病毒免疫中的作用进行了初步探索。结果如下:PfcGAS和PfcGASL与其他脊椎动物的cGAS基因具有相似的结构特征,但PfcGASL的C端还包含一个跨膜结构域。与人cGAS的亚细胞定位相似,PfcGAS在细胞中的分布存在三种情况:仅在胞质中、仅在细胞核中、胞质和核均有分布。PfcGASL则定位在内质网。PfcGAS和PfcGASL广泛分布在黄颡鱼组织中,并能被鲇爱德华氏菌、poly I:C和LPS诱导上调表达。二者能不同程度激活鱼类I型IFN启动子和ISRE（IFNstimulated response element）元件,暗示它们在干扰素的诱导激活中发挥功能。cGAS-like还能抑制poly I:C、polyd A:d T对IFN启动子的诱导,推测它可能参与天然免疫的调控。过表达PfcGAS基因能诱导IFN及IFN刺激效应基因（interferon-stimulated genes,ISGs）表达,并抑制鲤春病毒血症病毒（SVCV）和鲇爱德华氏菌（Edwardsiella ictaluri）的增殖。结合缺失突变和点突变,研究发现PfcGAS的1-206位氨基酸及第398、404、407、414位氨基酸在Pf GAS诱导IFN抗病作用中发挥重要作用。Pf irf1、Pf irf2A、Pf irf2B定位于细胞质和细胞核中,Pf irf8分布在细胞核中。初步的功能研究显示,Pf irf1能激活鱼类I型IFN启动子和ISRE元件,诱导IFN系统基因表达,并抑制SVCV增殖;Pf irf2A、Pf irf2B、Pf irf8抑制鱼类NF-κB、IFN启动子和ISRE元件。本文围绕黄颡鱼模式识别受体cGAS和cGASL及干扰素调控因子irf1、irf2和irf8的表达特征和功能特性进行了初步探索,研究结果有助于阐明黄颡鱼在应对病原微生物入侵时的免疫识别和应答机制,为抗病药物的研发乃至抗病育种奠定基础。

关键词：天然免疫模式识别受体 cGAS cGASL irf1 irf2 irf8 黄颡鱼