IRF1介导中间态细胞调控鼻息肉上皮细胞的分化作用

作     者：于鹏翼 

作者单位：青岛大学 

学位级别：硕士

导师姓名：宋西成

授予年度：2023年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100213[医学-耳鼻咽喉科学] 10[医学] 

主      题：慢性鼻-鼻窦炎伴鼻息肉 单细胞测序技术 上皮细胞 分化轨迹 IRF1 

摘      要：研究目的:慢性鼻-鼻窦炎伴鼻息肉(Chronic Rhinosinusitis with Nasal Polyps,CRSwNP)是一种伴有鼻塞、嗅觉减退、头痛等症状的鼻-鼻窦黏膜炎症性疾病,其发病机制复杂、术后复发率高且与下气道炎症的联系大,已造成患者严重的心理、经济负担。上皮细胞(Epithelial Cells,EC)的异常分化促进CRSwNP的发生和发展;然而,具体机制尚不清楚。我们拟构建一个来自CRSwNP患者鼻灌洗液细胞的单细胞图谱,描绘其EC的分化轨迹,并探讨异常EC分化在鼻息肉发病机制中的作用。研究方法:1.从3名CRSwNP患者和3名对照受试者的鼻腔灌洗液中分离出单细胞悬液作为实验样本。2.利用单细胞RNA测序(10×Genomics)测序技术对单细胞悬液样本进行捕获和测序。3.对测序数据进行质控、筛选,获得符合单细胞要求的高质量数据进行降维、聚类及可视化等常规分析。4.利用各细胞亚群差异标志基因对各细胞类型及EC亚群进行识别、鉴定和分群。5.通过基于一种细胞类型的受体表达和另一种细胞的相应配体表达而得出的受体-配体相互作用进行细胞间通讯分析。6.利用拟时序分析推断细胞亚群的分化先后顺序,并通过分支表达式分析建模(Branched Expression Analysis Modeling,BEAM)函数描绘各亚群中差异基因的分布差异情况。7.基因本体(Gene Ontology,GO)分析及京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encylopaedia of Genes and Genomes,KEGG)分析将各亚群细胞的差异基因与功能列表进行对应,探索各亚群及其差异基因的功能差异。8.单细胞调节网络推理和聚类(Single-cell Regulatory Network Inference and Clustering,SCENIC)分析通过计算靶基因的基因调控网络模块(regulon)的受试者工作特征曲线(Receiver Operating Characteristic Curve,ROC)下面积(Area Under Curve,AUC)值,评估转录因子的激活情况。9.探讨EC分化过程中基因表达的差异,使用蛋白质组学分析、免疫荧光和流式细胞术进行验证。研究结果:1.通过单细胞RNA测序,对6个样本的鼻灌洗液中29,393个合格单细胞进行数据分析。2.在数据质控、筛选、降维、可视化后,进行标志基因的比对,鉴定出多种EC和免疫细胞亚群,并重新鉴定出11种EC亚群。3.在每个EC亚群中,CRSwNP组和对照组之间均筛选出超过140个差异表达基因(Differentially Expressed Gene,DEG);其中,半胱氨酸蛋白酶抑制剂1(Cystatin SN,CST1)和凝溶胶蛋白(Gelsolin,GSN)在所有EC亚群中均呈上调趋势,因此被称为核心DEG。4.拟时序分析描绘出鼻灌洗液中EC的分化轨迹,EC的异常分化轨迹最初出现在CRSwNP组的MUC5ACFOXJ1细胞亚群(中间态细胞)中,免疫荧光染色及流式细胞分析均证实鼻粘膜组织中存在中态间细胞。5.中间态细胞状态的出现与转录因子干扰素调节因子1(Interferon Regulatory Factor 1,IRF1)的低表达密切相关。流式细胞分析显示,与对照组相比,CRSwNP组鼻灌洗液中IRF1中间态细胞的比例显著降低。***组中,富集于拟时序树短分支的FOXJ1PIFOPOS1ECRG4纤毛细胞(纤毛细胞2)中也表现出IRF1的降低。IRF1通过靶向CRSwNP中的下游信号分子(IFI6、GBP1、PSMB8、PSMB9和RARRES3)来控制中间态细胞到纤毛细胞2的异常分化。结论:IRF1作为核心转录因子不仅参与CRSwNP患者中间态细胞的异常分化,还在随后的异常纤毛细胞分化中发挥持续的调节作用。从IRF1中间态细胞向IRF1纤毛细胞2的分化过程直接导致EC的功能障碍,并进一步促进CRSwNP的发生和发展,这有助于开发治疗CRSwNP的新策略。