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rhoa—rock信号通路抑制剂对缺氧人肺微血管内皮细胞丝状肌动蛋白细胞骨架的影响

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中国小儿急救医学 2012年第1期19卷 67-70页

作者：张费通崔其亮莫镜广州医学院第三附属医院儿科广州510150

目的用rhoa—rock信号通路抑制剂探讨肺出血时肺微血管内皮细胞的调控因素。方法人肺微血管内皮细胞常规培养，分为4组：对照组、抑制剂组、缺氧组和抑制剂缺氧组。异硫氰酸荧光素一鬼笔环肽与胞浆内丝状肌动蛋白（filamentous actin，F... 详细信息

目的用rhoa—rock信号通路抑制剂探讨肺出血时肺微血管内皮细胞的调控因素。方法人肺微血管内皮细胞常规培养，分为4组：对照组、抑制剂组、缺氧组和抑制剂缺氧组。异硫氰酸荧光素一鬼笔环肽与胞浆内丝状肌动蛋白（filamentous actin，F—actin）结合而发出红色荧光，共聚焦显微镜扫描观察F—actin的变化情况并记录相应荧光值。结果细胞缺氧组1h、12h和24h的F—actin平均荧光强度分别为对照组的（64．3±5．5）％、（60．3±4．2）％和（47．8±4．6）％；抑制剂缺氧组1h、12h和24h分别为对照组的（66．2±3．2）％、（67．1±6．2）％和（72．5±6．1）％。细胞缺氧组缺氧1h后，F—actin平均荧光强度降低[（64．3±5．5）％]，与对照组比较差异有统计学意义（P〈0．05），至缺氧24h，F—actin含量已下降至对照组的（47．8±4．6）％，差异有统计学意义（P〈0．05）。抑制剂缺氧组缺氧1h后，F—actin平均荧光强度较缺氧组1h有所升高，为对照组的（66．2±3．2）％，抑制剂组缺氧24h后***平均荧光强度为对照组的（72．5±6．1）％，与缺氧组缺氧24h相比差异有统计学意义（P〈0．05）。而抑制剂组不经缺氧的F—actin平均荧光强度与对照组相比无显著变化（P〉0．05）。缺氧后细胞皮质状结构消失，应力纤维排列紊乱，随着缺氧时间的延长，F—actin逐渐解聚断裂。用rhoa-rock信号通路抑制剂预处理细胞后再缺氧，核周围F—actin所形成的皮质状结构重新出现，细胞浆内应力纤维的排列和分布趋向于规律，F—actin断裂减少。结论rhoa—rock信号通路在肺微血管内皮细胞缺氧过程中介导了F—actin的损伤，用rhoa-rock信号通路抑制剂干预可以为新生儿肺出血的治疗研究提供一个新的方向。

关键词：肺出血肺微血管内皮细胞丝状肌动蛋白 rhoa-rock信号通路婴儿,新生

脑血管内皮细胞中CSE生成的H2S对海马神经元缺氧性损伤的保护作用及其抑制rhoa-rock信号通路的机制

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脑血管内皮细胞中CSE生成的H2S对海马神经元缺氧性损伤的保护作用...

作者：管千军安徽医科大学

学位级别：硕士

背景:脑中风是一种有高发病率、高死亡率的急性脑血管病,目前已成为残疾和死亡的第二大原因。其主要发病机制是缺血再灌注,它可以诱导周围神经元产生明显的氧化损伤。硫化氢（Hydrogen sulfide,HS）是一种气体信号分子,在脑中风中起到... 详细信息

背景:脑中风是一种有高发病率、高死亡率的急性脑血管病,目前已成为残疾和死亡的第二大原因。其主要发病机制是缺血再灌注,它可以诱导周围神经元产生明显的氧化损伤。硫化氢（Hydrogen sulfide,HS）是一种气体信号分子,在脑中风中起到至关重要的作用。内源性HS可以由胱硫醚-β-合成酶（cyste-beta-synthase,CBS）和胱硫醚-γ-裂解酶（cyste-gamma-lyase,CSE）催化半胱氨酸（cysteine,Cys）生成,此外3-巯基丙酮酸硫转移酶（3-mercaptopyruvate sulfur transferase,3-MST）可以联合半胱氨酸氨基转移酶（Cysteine aminotransferase,CAT）生成HS。CBS主要分布在中枢神经系统中,CSE主要分布在心血管系统中。3-MST在脑细胞、血管内皮细胞等中均有表达。因此内皮源性HS存在着CSE产生的HS（CSE-produced HS）和3-MST产生的HS（3-MST-produced HS）两种途径。rhoa-rock信号通路与心脑血管疾病的病理机理密切相关,是心脑血管系统的新靶点。Ras同源家族成员A（Ras homolog family member A,rhoa）是小分子鸟苷酸结合蛋白,rock是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,包括Rho相关卷曲螺旋形蛋白激酶1（Rho-associated coiled coil-containing protein kinase 1,rock）和Rho相关卷曲螺旋形蛋白激酶2（Rho-associated coiled coil-containing protein kinase 2,rock）两种亚型。研究表明抑制rhoa-rock信号通路可以保护脑神经细胞。本课题拟确定内皮细胞中CSE产生的HS是否对神经细胞缺氧损伤有保护作用,以及内皮细胞中CSE产生的HS与rhoa-rock信号通路之间的相互作用。目的:1.研究内皮细胞中CSE产生的HS对海马神经细胞OGD/R损伤有无保护作用。2.研究内皮细胞中CSE产生的HS对海马神经细胞OGD/R损伤的作用及与rhoa-rock信号通路的关系。方法:1.研究脑血管内皮细胞中CSE产生的HS对原代大鼠海马神经细胞OGD/R损伤的影响,使用L-Cys作为内源性HS供体。原代培养大鼠海马神经细胞和脑血管内皮细胞,再对两种细胞进行共培养。1.1两种细胞共培养后分为Control组、OGD/R组、OGD/R+Na HS(200μmol·L)组、OGD/R+L-Cys(50、100、200μmol·L)六组。Na HS作为阳性对照,确定L-Cys的合适剂量。通过试剂盒检测乳酸脱氢酶LDH、神经元特异性烯醇化酶NSE,通过CCK8法检测细胞活力,亚甲基蓝法检测HS含量。1.2两种细胞共培养后分为Control组、OGD/R组、OGD/R+L-Cys(200μmol·L)组、OGD/R+PPG组、OGD/R+L-Cys(200μmol·L)+PPG五组,通过试剂盒检测LDH、NSE,通过CCK8法检测细胞活力,亚甲基蓝法测定HS含量,Annexin-FITC/PI双染试剂盒检测细胞凋亡。2.研究脑血管内皮细胞中CSE产生的HS对原代海马神经细胞OGD/R损伤的作用及与rhoa-rock信号通路之间的关系。2.1两种细胞共培养后分为Control组、OGD/R组、OGD/R+L-Cys(200μmol·L)组、OGD/R+PPG组、OGD/R+L-Cys(200μmol·L)+PPG五组,使用rhoa、rock活性检测试剂盒检测rhoa、rock活性,采用Western blot法检测rhoa、rock蛋白表达;2.2原代培养CSE基因敲除及野生型小鼠脑血管内皮细胞（EC）和原代小鼠海马神经细胞（NC）,将细胞分成:（1）NC+EC;（2）NC+EC。每组均加入CBS抑制剂2-甲氧基-N-乙酰基苯胺（O-Acetoacetaniside,AOAA）、3-MST抑制剂天门冬氨酸（L-aspartic acid,L-Asp）、CSE底物L-半胱氨酸（L-cysteine,L-Cys）。亚甲基蓝法检测HS含量。Western blot检测rhoa、rock蛋白表达及对应的磷酸化蛋白表达。结果:1.1（1）与正常对照组比较,OGD/R组细胞活力明显降低,LDH和NSE水平明显升高（P<0.01）,L-Cys(100、200μmol·L)组显著减弱OGD/R损伤导致的海马神经细胞活力的降低,使OGD/R损伤的神经细胞中LDH及NSE活性均下降。此外,给予阳性对照药Na HS(200μmol·L)与L-Cys(100、200μmol·L)有类似的作用效果。表明脑血管内皮细胞中

关键词：硫化氢共培养 rhoa-rock信号通路氧糖剥夺再复氧损伤

杜鹃花总黄酮抗大鼠脑血管内皮细胞缺氧性损伤作用及其促进H2S生成抑制rhoa-rock信号通路的机制

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杜鹃花总黄酮抗大鼠脑血管内皮细胞缺氧性损伤作用及其促进H2S生...

作者：奚娇娇安徽医科大学

学位级别：硕士

背景:缺血性脑部疾病是全世界人类死亡一个主要原因的疾病,随着年龄的增长,它发生的概率也越发增大。脑缺血/再灌注(I/R)损伤是指脑部缺血一段时间后再恢复血液供应而产生的损伤。当前,我们对于缺血缺氧性脑部疾病的具体机制尚未完全清... 详细信息

背景:缺血性脑部疾病是全世界人类死亡一个主要原因的疾病,随着年龄的增长,它发生的概率也越发增大。脑缺血/再灌注(I/R)损伤是指脑部缺血一段时间后再恢复血液供应而产生的损伤。当前,我们对于缺血缺氧性脑部疾病的具体机制尚未完全清楚,并且针对其治疗药物的开发也未有很大进展。有研究表明,Rho A-rock通路参与了缺血性脑损伤的病理过程,缺血性脑损伤可诱导Rho A激活,rock和rock表达和活性上调,导致神经元细胞死亡,抑制Rho A-rock通路可使脑缺血损伤的大鼠海马神经损伤减小,并且研究已证实内皮源性HS可抑制Rho A-rock信号通路对抗缺血性脑损伤。杜鹃花总黄酮(total flavones of rhododendra,TFR)是从杜鹃花中提取的黄酮类有效部位,具有保护心脑血管方面的作用。前期研究发现TFR有明显抗缺血性脑损伤作用,并初步表明缺氧性损伤可导致脑血管内皮细胞中CSE蛋白表达和HS生成的减少,但尚不清楚TFR对缺氧性损伤中的脑血管内皮细胞有无保护作用及其与HS生成的关系。同样地,TFR对脑血管内皮中Rho A-rock信号通路影响的研究也未见报道。因此,本研究旨在探讨TFR对大鼠脑血管内皮细胞缺氧性损伤有无保护作用,并探讨其作用与HS生成及Rho A-rock信号通路的关系,为缺血性脑部疾病提供新的治疗思路。目的:1.研究TFR对H/R大鼠脑血管内皮细胞损伤有无保护作用。2.研究TFR对H/R大鼠脑血管内皮细胞保护作用的作用与HS以及Rho A-rock信号通路的关系。方法:培养原代大鼠脑血管内皮细胞,构建缺氧复氧模型(H/R)。分组为Control、Model、ACh(1μmol/L)、TFR(90mg/L、270mg/L、810mg/L)、ACh(1μmol/L)+PPG(100μmol/L)、TFR(810mg/L)+PPG(100μmol/L)、ACh(1μmol/L)+ASP(100μmol/L)、TFR(810mg/L)+ASP(100μmol/L)、CCG-1423(1μmol/L)、TFR(810mg/L)+CCG-123(1μmol/L)组。缺氧8h,复氧6h后,采用CCK-8试剂盒检测细胞活力,试剂盒检测LDH活性、MDA以及HS含量,Western blot检测CSE、3-MST、Rho A、rock、rock蛋白表达,ELISA检测Rho A、rock1、rock2活性。结果:1.与对照组相比,模型组细胞活力显著降低,MDA和LDH水平显著提高(Prock、rock和Rho A蛋白表达和活性显着增加(Prock、rock和Rho A蛋白的表达和活性(Prock、rock及Rho A蛋白表达与活性升高作用有明显的减弱(Prock、rock和Rho A蛋白表达与活性的

关键词：杜鹃花总黄酮 rhoa-rock信号通路硫化氢缺氧复氧

针刺结合益气健脾中药复方对糖尿病胃轻瘫大鼠胃动力及rhoa-rock信号通路的影响

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针刺结合益气健脾中药复方对糖尿病胃轻瘫大鼠胃动力及RhoA-ROCK...

作者：崔晶晶锦州医科大学

学位级别：硕士

目的观察针刺结合益气健脾中药复方对糖尿病胃轻瘫(Diabetic gastroparesis,DGP)大鼠的作用效果,通过检测其对胃排空率、小肠推进率及rhoa-rock信号通路、p-MYPT1、p-MLC蛋白的影响,探究其影响DGP大鼠胃肠动力的作用机制,为DGP的治疗提... 详细信息

目的观察针刺结合益气健脾中药复方对糖尿病胃轻瘫(Diabetic gastroparesis,DGP)大鼠的作用效果,通过检测其对胃排空率、小肠推进率及rhoa-rock信号通路、p-MYPT1、p-MLC蛋白的影响,探究其影响DGP大鼠胃肠动力的作用机制,为DGP的治疗提供更好的方法和依据。方法采用链脲佐菌素(Streptozocin,STZ)尾静脉注射及高糖高脂不规则喂养法制备DGP模型,将成模大鼠随机分为模型组、针刺组、益气健脾中药复方组(中药组)、针刺结合益气健脾中药复方组(针药组)和多潘立酮组(西药组)。针刺组每日给予三阴交、足三里穴针刺30min治疗,中药组每日给予益气健脾中药复方5g/kg灌胃;针药组先给予益气健脾中药复方5g/kg灌胃,再行针刺(操作同针刺组);西药组每日抓取固定30min,给予多潘立酮3.15×10 g/kg灌胃;模型组和空白组每日抓取固定30min,给予生理盐水10ml/kg灌胃一次;所有治疗持续4周。实验过程中记录大鼠血糖、体重、饮食量、毛色、精神状态等一般情况,疗程干预完毕时,用酚红法检测胃排空率、小肠推进率,HE染色观察胃窦粘膜病理改变,免疫组化法测定胃窦中Ras同源物基因组成员A(rhoa)、Rho蛋白相关卷曲螺旋激酶2(rock2)的含量,免疫印迹(Western blotting,WB)法测定胃窦组织中磷酸化肌球蛋白轻链(p-MLC)、磷酸化肌球蛋白磷酸酶靶亚单位1(p-MYPT1)蛋白的表达。结果与空白组比较:模型组大鼠症状积分及血糖显著增高(Prhoa、rock2、p-MYPT1、p-MLC蛋白表达水平显著降低(P0.05)。(2)各治疗组胃排空率、小肠推进率均不同程度加快(Prhoa、rock2、p-MYPT1、p-MLC蛋白表达水平均升高(Prhoa/rock信号通路,增加p-MYPT1、p-MLC蛋白的表达,促进胃平滑肌收缩有关。

关键词：糖尿病胃轻瘫针刺益气健脾中药复方 rhoa-rock信号通路

基于rhoa/rock信号通路研究18β-甘草次酸对肺动脉高压大鼠的保护作用

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基于RhoA/ROCK信号通路研究18β-甘草次酸对肺动脉高压大鼠的保护...

作者：张敏宁夏医科大学

学位级别：硕士

目的:观察18β-甘草次酸(18β-Glycyrrhetinic Acid,18β-GA)对肺动脉高压的保护作用并探讨相关作用机制。方法:本研究采用两种模型,通过对SD大鼠(Sprague-Dawle rat)单次腹部皮下注射野百合碱(60 mg/kg)建立大鼠肺动脉高压模型以及通过... 详细信息

目的:观察18β-甘草次酸(18β-Glycyrrhetinic Acid,18β-GA)对肺动脉高压的保护作用并探讨相关作用机制。方法:本研究采用两种模型,通过对SD大鼠(Sprague-Dawle rat)单次腹部皮下注射野百合碱(60 mg/kg)建立大鼠肺动脉高压模型以及通过PDGF-BB(20ng/ml)刺激建立人肺动脉平滑肌细胞(HPASMCs)增殖模型。采用右心导管法检测大鼠血流动力学参数(mPAP、RVSP);采用脏器称重法检测大鼠右心肥厚(RVH);采用H.E染色法观察大鼠肺血管形态学变化;采用Masson染色法观察大鼠肺组织中胶原纤维增生情况;采用免疫组织化学染色法检测大鼠肺组织中平滑肌动蛋白(α-SMA)的表达;采用Western blot技术检测大鼠肺组织中rhoa、rock1、rock2蛋白的表达水平;采用细胞增殖检测技术观察18β-甘草次酸对HPASMCs增殖的影响;采用流式细胞术检测18β-甘草次酸对HPASMCs的细胞周期的影响;采用Western blot技术检测18β-甘草次酸对HPASMCs中rhoa、rock1、rock2、p-MYPT1、t-MYPT1、Bax、Bcl-2、p27蛋白表达的影响;采用RT-qRCR法检测18β-甘草次酸对HPASMCs中rhoa、rock1、rock2mRNA表达的影响。结果:血流动力学指标检测结果表明,MCT组大鼠的mPAP、RVSP以及右心肥厚指数(RVHI)与正常组相比显著升高,给药不同剂量18β-甘草次酸(100、50mg/kg)治疗后,mPAP、RVSP、RVHI与模型组相比显著降低;H.E染色结果显示,与对照组相比,模型组大鼠肺中小动脉血管壁显著增厚,血管管腔面积狭窄,与模型组相比,18β-甘草次酸(100、50 mg/kg)能够显著改善大鼠肺中小动脉重构;Masson染色结果显示,MCT组大鼠肺组织胶原纤维化显著,肌纤维无规则排列,给予18β-甘草次酸(100、50 mg/kg)剂量治疗后可显著改善肺动脉高压大鼠肺组织中胶原纤维增生情况,肌纤维排列连续,趋于整齐;免疫组织化学染色结果显示,与正常对照组相比,模型组大鼠肺组织中α-SMA的表达水平显著增加,与模型组比较,给予18β-甘草次酸(100 mg/kg)治疗能降低大鼠肺组织中α-SMA的表达水平;Western blot结果显示,18β-甘草次酸(100 mg/kg)可以明显下调在肺动脉高压模型大鼠肺组织中过高表达的rhoa、rock1、rock2;细胞增殖实验结果显示,18β-甘草次酸(80、160μM)对HPASMCs的增殖具有抑制作用;流式细胞术实验结果表明18β-甘草次酸(80、160μM)具有阻滞HPASMCs细胞周期的作用;Western blot结果显示,18β-甘草次酸(160μM)可以显著降低在HPASMCs中高表达的rhoa、rock1、rock2、Bcl-2和过高表达的p-MYPT1/t-MYPT1比例,并且能够明显提高p27、Bax的蛋白表达;RT-qRCR结果显示,对比模型组,18β-甘草次酸(160μM)能够显著抑制HPASMCs中rhoa、rock1、rock2 mRNA表达。结论1.18β-甘草次酸对MCT诱导的肺动脉高压具有保护作用;2.18β-甘草次酸对PDGF-BB诱导的HPASMCs增殖具有抑制作用;3.18β-甘草次酸通过调节rhoa-rock信号传导途径改善肺动脉高压的发展。

关键词： 18β-甘草次酸肺动脉高压血管重构 rhoa-rock信号通路

H2S舒张大鼠脑血管作用与rhoa及rock关系的研究

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中国药理学通报 2020年第7期36卷 952-956页

作者：刘欣陈志武郭岩安徽医科大学基础医学院药理学教研室安徽合肥230032

目的研究H2S舒张大鼠脑血管作用与rhoa和rock的关系。方法利用离体微血管压力直径测定法检测大鼠脑基底动脉(CBA)的舒张作用,用rhoa抑制剂C3预处理后抑制rhoa活性,用siRNA转染技术在体敲低大鼠rock1和rock2表达。结果在1×10^-6~1×10^-... 详细信息

目的研究H2S舒张大鼠脑血管作用与rhoa和rock的关系。方法利用离体微血管压力直径测定法检测大鼠脑基底动脉(CBA)的舒张作用,用rhoa抑制剂C3预处理后抑制rhoa活性,用siRNA转染技术在体敲低大鼠rock1和rock2表达。结果在1×10^-6~1×10^-3 mol·L^-1范围内,NaHS呈浓度依赖性地诱导大鼠CBA舒张,但这种舒张作用可被1×10^-5mol·L^-1C3预处理明显减弱;rock1-siRNA或rock2-siRNA在体转染均可明显地敲低大鼠CBA中的rock1或rock2表达;在rock1或rock2表达敲低的大鼠CBA上,NaH S诱导的血管舒张作用有明显的降低。结论 H2S通过作用于rhoa、rock1和rock2导致rhoa-rock信号通路的抑制来发挥舒张大鼠脑血管作用。

关键词：硫化氢 rhoa-rock信号通路 siRNA转染脑基底动脉舒张血管直径

体外沉默ICMT基因对人唾液腺腺样囊性癌细胞侵袭和迁移的影响

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口腔疾病防治 2023年第6期31卷 400-407页

作者：陆洲宫文红许晓陈正岗潍坊医学院口腔医学院山东潍坊(261021 青岛大学附属青岛市市立医院口腔医学中心山东青岛(266071

目的探讨异戊二烯基半胱氨酸羧基甲基转移酶(isoprene cysteine carboxymethyl transferase,ICMT)基因对唾液腺腺样囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma,SACC)细胞迁移和侵袭的影响及相关机制,为SACC的分子靶向治疗提供实验依据... 详细信息

目的探讨异戊二烯基半胱氨酸羧基甲基转移酶(isoprene cysteine carboxymethyl transferase,ICMT)基因对唾液腺腺样囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma,SACC)细胞迁移和侵袭的影响及相关机制,为SACC的分子靶向治疗提供实验依据。方法体外培养腺样囊性癌细胞SACC-LM和SACC-83,采用脂质体载体瞬时转染的方法,将ICMT siRNA转染至人SACC-LM和SACC-83细胞中(实验组),并分别设置空白对照组和阴性对照组(转染NC-siRNA)。通过qRT-PCR检测转染后各组细胞中ICMT和rhoa的m RNA表达并明确沉默效率;Western blot检测各组的ICMT、膜rhoa、总rhoa、Rho关联含卷曲螺旋结合蛋白激酶1(Rho associations contain curly helical binding protein kinase 1,rock1)、基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)蛋白表达;通过CCK-8实验检测SACC细胞的增殖能力;通过比较细胞划痕实验的相对愈合面积和Transwell实验细胞穿膜数目,分别检测SACC细胞的迁移和侵袭能力。结果 SACC-LM和SACC-83细胞转染ICMT-siRNA后,实验组相较于空白对照组和阴性对照组,ICMT mRNA和蛋白表达显著下降(Prhoa mRNA和rhoa总蛋白表达均无显著性差异(P>0.05);膜rhoa、rock1、MMP-2、MMP-9的蛋白表达显著下降(Prhoa-rock信号通路有关。

关键词：腺样囊性癌 rhoa 异戊二烯基半胱氨酸羧基甲基转移酶小干扰RNA 侵袭迁移 Rho关联含卷曲螺旋结合蛋白激酶1 基质金属蛋白酶-2 基质金属蛋白酶-9 rhoa-rock信号通路

沉默SEMA4D对骨肉瘤细胞增殖、侵袭、凋亡的影响及机制

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现代肿瘤医学 2021年第12期29卷 2041-2045页

作者：李刚尚驰欧学海张红星魏登科西安交通大学附属红会医院手外一病区陕西西安710054 西安交通大学附属红会医院手外二病区陕西西安710054

目的:研究沉默SEMA4D对骨肉瘤细胞增殖、侵袭和凋亡的影响,并探索其作用机制。方法:体外培养人骨肉瘤HOS和U2OS细胞并转染SEMA4D-siRNA(si-SEMA4D)。采用CCK-8、Annexin-V/PI双染、Caspase 3/7活性细胞凋亡、Transwell实验检测si-SEMA4... 详细信息

目的:研究沉默SEMA4D对骨肉瘤细胞增殖、侵袭和凋亡的影响,并探索其作用机制。方法:体外培养人骨肉瘤HOS和U2OS细胞并转染SEMA4D-siRNA(si-SEMA4D)。采用CCK-8、Annexin-V/PI双染、Caspase 3/7活性细胞凋亡、Transwell实验检测si-SEMA4D对细胞增殖、凋亡和侵袭等的影响。结果:SEMA4D在骨肉瘤组织和细胞中高表达。转染si-SEMA4D可有效地抑制HOS和U2OS细胞中SEMA4D的表达,同时转染si-SEMA4D显著降低了HOS和U2OS细胞的增殖能力和侵袭能力,诱导了HOS和U2OS细胞的凋亡。此外,转染si-SEMA4D显著抑制了MMP2/9、rhoa、rock1/2的表达。结论:SEMA4D在骨肉瘤组织和细胞中表达上调。抑制SEMA4D可能通过调控rhoa-rock信号通路和MMP2/9的表达诱导骨肉瘤细胞凋亡并抑制细胞增殖和侵袭。

关键词： SEMA4D 骨肉瘤侵袭 MMP-2/9 rhoa-rock信号通路

H2S舒张大鼠脑血管的rhoa和rock靶点抑制作用及其后续机制

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H2S舒张大鼠脑血管的RhoA和ROCK靶点抑制作用及其后续机制

作者：刘欣安徽医科大学

学位级别：硕士

脑血管病是一种在临床上的常见疾病,是导致世界各地人们死亡的主要原因,其中缺血性脑血管病更为常见。但是其具体的发生发展的病理生理机制目前仍不是十分清楚。硫化氢(Hydrogen sulfide,HS)是继一氧化氮(nitric oxide,NO)和一氧化碳(ca... 详细信息

脑血管病是一种在临床上的常见疾病,是导致世界各地人们死亡的主要原因,其中缺血性脑血管病更为常见。但是其具体的发生发展的病理生理机制目前仍不是十分清楚。硫化氢(Hydrogen sulfide,HS)是继一氧化氮(nitric oxide,NO)和一氧化碳(carbon monoxide,CO)之后在体内发现的第3种气体信号分子。与NO一样,内源性HS也可由血管内皮细胞产生和释放,调节血管张力和器官血流量。Rho A-rock信号通路参与血管床中平滑肌细胞的收缩,在血管张力调节中发挥重要的作用,是心脑血管系统的新靶点。小G蛋白Rho A及其与Rho相关的卷曲螺旋形成的下游效应子激酶(rho-associated coiled-coilcontaining kinases,rocks)在心血管发病机制中都具有重要作用,rock也可在血管平滑肌上表达。Rho A-rock信号通路参与血管的调节张力,并参与血管床的血管平滑肌细胞收缩。rocks是小分子鸟苷酸结合蛋白Rho A的主要效应分子,同时有研究表明rocks在血管内皮细胞和平滑肌细胞中均有一定表达,rock分别有rock和rock两种亚型,它们在氨基酸序列和激酶结构域上具有一定的同源性,rock主要在非神经组织中表达,例如肺,肾和骨骼肌,而rock主要在中枢神经系统中表达,包括海马锥体神经元,大脑皮层和小脑Purkinje细胞。在静息状态下,Rho A位于胞质中,活化后可转移到胞膜上。随后活化下游的rock,使肌球蛋白轻链脱磷酸化酶(myosin light chain phosphorylase,MLCP)的肌球蛋白结合亚基(myosin binding subunit,MBS)磷酸化,使MLCP失活,磷酸化的肌球蛋白轻链(myosin light chain,p-MLC)不能脱磷酸,并且rock也使MLC直接磷酸化,提高p-MLC水平,使平滑肌收缩性增强,最终使动脉发生痉挛反应,从而引发一系列的心血管疾病。我们以前通过CSE基因敲除小鼠模型研究HS-Rho A-rock信号通路在调节小鼠脑基底动脉张力中的作用的研究,结果显示HS可能通过抑制Rho A-rock信号通路诱导脑血管舒张。但尚不明确其抑制Rho A-rock信号通路的确切靶点,即HS是抑制Rho A,还是抑制rock及对其亚型有无选择性,同时也研究了对p-MLC的表达和细胞内游离Ca的影响。因此,本课题对HS舒张大鼠脑血管的Rho A和rock靶点抑制作用及其后续机制进行了研究。目的:1、研究HS舒张大鼠脑血管作用与Rho A和rock的关系。2、研究HS舒张大鼠脑血管平滑肌细胞作用与Rho A和rock的关系。3、研究HS抑制Rho A和rock对p-MLC蛋白表达和细胞内游离Ca的影响。方法:1、采用si RNA体内干扰技术,建立转染模型,减低脑血管中rockrock蛋白的表达。2、离体微血管压力直径测定法检测大鼠脑基底动脉的舒张作用。3、大鼠脑血管平滑肌细胞原代培养,鉴定。4、计算机图像分析系统测定平滑肌细胞的舒张幅度。5、Elisa试剂盒检测rock和rock活性。6、钙离子成像系统测定平滑肌细胞内钙离子荧光强度。7、采用Western-Blot检测HS对rock下游蛋白肌球蛋白轻链磷酸化表达的影响。结果:1.在1×10～1×10mol/L范围内,Na HS呈浓度依赖性地诱导大鼠脑基底舒张,但这种舒张作用可被1×10 mol/L Rho A抑制剂C3转移酶预处理明显减弱。rock-si RNA或rock-si RNA在体转染均可明显地减弱大鼠脑基底动脉中的rock或rock表达;在rock或rock表达敲低的大鼠脑基底动脉上,Na HS诱导的血管舒张作用有明显的降低。与rock或rock表达敲低组相比,C3转移酶预处理组对减弱Na HS诱导的血管舒张作用更明显。2.与对照组比较,Na HS在一定达到一定浓度(100μmol/L)后诱导大鼠脑基底动脉平滑肌细胞的舒张,但这种舒张作用可被1μg/ml C3转移酶预处理减弱,10μmol/L的Y27632预处理也可以减弱Na HS舒张作用。同时,在基底动脉平滑肌细胞用30 mmol/L氯化钾预收缩的的情况下,在减弱Na HS对大鼠基底动脉平滑肌细胞舒张幅度上C3转移酶预处理组较Y27632预处理组大。3.与对照组相比,外源性HS(Na HS:100μmol/L)可以显著减弱rock、rock活性,单用C3转移酶处理后,也可以降低rock、rock活性。与Na HS组相比,用C3转移酶预处理后再加入Na HS会使rock、rock活性有所降低。4.与对照组相比,外源性HS(Na HS:100μmol/L)引起大鼠脑基底动脉平滑肌细胞p-MLC蛋白表达的显着降低(P

关键词：硫化氢血管舒张大脑基底动脉平滑肌细胞 rhoa-rock信号通路