H2S舒张大鼠脑血管的RhoA和ROCK靶点抑制作用及其后续机制

作     者：刘欣 

作者单位：安徽医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：郭岩

授予年度：2020年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100204[医学-神经病学] 10[医学] 

主      题：硫化氢 血管舒张 大脑基底动脉 平滑肌细胞 RhoA-ROCK信号通路 

摘      要：脑血管病是一种在临床上的常见疾病,是导致世界各地人们死亡的主要原因,其中缺血性脑血管病更为常见。但是其具体的发生发展的病理生理机制目前仍不是十分清楚。硫化氢(Hydrogen sulfide,HS)是继一氧化氮(nitric oxide,NO)和一氧化碳(carbon monoxide,CO)之后在体内发现的第3种气体信号分子。与NO一样,内源性HS也可由血管内皮细胞产生和释放,调节血管张力和器官血流量。Rho A-ROCK信号通路参与血管床中平滑肌细胞的收缩,在血管张力调节中发挥重要的作用,是心脑血管系统的新靶点。小G蛋白Rho A及其与Rho相关的卷曲螺旋形成的下游效应子激酶(rho-associated coiled-coilcontaining kinases,ROCKs)在心血管发病机制中都具有重要作用,ROCK也可在血管平滑肌上表达。Rho A-ROCK信号通路参与血管的调节张力,并参与血管床的血管平滑肌细胞收缩。ROCKs是小分子鸟苷酸结合蛋白Rho A的主要效应分子,同时有研究表明ROCKs在血管内皮细胞和平滑肌细胞中均有一定表达,ROCK分别有ROCK和ROCK两种亚型,它们在氨基酸序列和激酶结构域上具有一定的同源性,ROCK主要在非神经组织中表达,例如肺,肾和骨骼肌,而ROCK主要在中枢神经系统中表达,包括海马锥体神经元,大脑皮层和小脑Purkinje细胞。在静息状态下,Rho A位于胞质中,活化后可转移到胞膜上。随后活化下游的ROCK,使肌球蛋白轻链脱磷酸化酶(myosin light chain phosphorylase,MLCP)的肌球蛋白结合亚基(myosin binding subunit,MBS)磷酸化,使MLCP失活,磷酸化的肌球蛋白轻链(myosin light chain,p-MLC)不能脱磷酸,并且ROCK也使MLC直接磷酸化,提高p-MLC水平,使平滑肌收缩性增强,最终使动脉发生痉挛反应,从而引发一系列的心血管疾病。我们以前通过CSE基因敲除小鼠模型研究HS-Rho A-ROCK信号通路在调节小鼠脑基底动脉张力中的作用的研究,结果显示HS可能通过抑制Rho A-ROCK信号通路诱导脑血管舒张。但尚不明确其抑制Rho A-ROCK信号通路的确切靶点,即HS是抑制Rho A,还是抑制ROCK及对其亚型有无选择性,同时也研究了对p-MLC的表达和细胞内游离Ca的影响。因此,本课题对HS舒张大鼠脑血管的Rho A和ROCK靶点抑制作用及其后续机制进行了研究。目的:1、研究HS舒张大鼠脑血管作用与Rho A和ROCK的关系。2、研究HS舒张大鼠脑血管平滑肌细胞作用与Rho A和ROCK的关系。3、研究HS抑制Rho A和ROCK对p-MLC蛋白表达和细胞内游离Ca的影响。方法:1、采用si RNA体内干扰技术,建立转染模型,减低脑血管中ROCKROCK蛋白的表达。2、离体微血管压力直径测定法检测大鼠脑基底动脉的舒张作用。3、大鼠脑血管平滑肌细胞原代培养,鉴定。4、计算机图像分析系统测定平滑肌细胞的舒张幅度。5、Elisa试剂盒检测ROCK和ROCK活性。6、钙离子成像系统测定平滑肌细胞内钙离子荧光强度。7、采用Western-Blot检测HS对ROCK下游蛋白肌球蛋白轻链磷酸化表达的影响。结果:1.在1×10～1×10mol/L范围内,Na HS呈浓度依赖性地诱导大鼠脑基底舒张,但这种舒张作用可被1×10 mol/L Rho A抑制剂C3转移酶预处理明显减弱。ROCK-si RNA或ROCK-si RNA在体转染均可明显地减弱大鼠脑基底动脉中的ROCK或ROCK表达;在ROCK或ROCK表达敲低的大鼠脑基底动脉上,Na HS诱导的血管舒张作用有明显的降低。与ROCK或ROCK表达敲低组相比,C3转移酶预处理组对减弱Na HS诱导的血管舒张作用更明显。2.与对照组比较,Na HS在一定达到一定浓度(100μmol/L)后诱导大鼠脑基底动脉平滑肌细胞的舒张,但这种舒张作用可被1μg/ml C3转移酶预处理减弱,10μmol/L的Y27632预处理也可以减弱Na HS舒张作用。同时,在基底动脉平滑肌细胞用30 mmol/L氯化钾预收缩的的情况下,在减弱Na HS对大鼠基底动脉平滑肌细胞舒张幅度上C3转移酶预处理组较Y27632预处理组大。3.与对照组相比,外源性HS(Na HS:100μmol/L)可以显著减弱ROCK、ROCK活性,单用C3转移酶处理后,也可以降低ROCK、ROCK活性。与Na HS组相比,用C3转移酶预处理后再加入Na HS会使ROCK、ROCK活性有所降低。4.与对照组相比,外源性HS(Na HS:100μmol/L)引起大鼠脑基底动脉平滑肌细胞p-MLC蛋白表达的显着降低(P