基于RhoA/ROCK信号通路研究18β-甘草次酸对肺动脉高压大鼠的保护作用

作     者：张敏 

作者单位：宁夏医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：周茹;徐清斌;郝银菊

授予年度：2019年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：18β-甘草次酸 肺动脉高压 血管重构 RhoA-ROCK信号通路 

摘      要：目的:观察18β-甘草次酸(18β-Glycyrrhetinic Acid,18β-GA)对肺动脉高压的保护作用并探讨相关作用机制。方法:本研究采用两种模型,通过对SD大鼠(Sprague-Dawle rat)单次腹部皮下注射野百合碱(60 mg/kg)建立大鼠肺动脉高压模型以及通过PDGF-BB(20ng/ml)刺激建立人肺动脉平滑肌细胞(HPASMCs)增殖模型。采用右心导管法检测大鼠血流动力学参数(mPAP、RVSP);采用脏器称重法检测大鼠右心肥厚(RVH);采用H.E染色法观察大鼠肺血管形态学变化;采用Masson染色法观察大鼠肺组织中胶原纤维增生情况;采用免疫组织化学染色法检测大鼠肺组织中平滑肌动蛋白(α-SMA)的表达;采用Western blot技术检测大鼠肺组织中RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白的表达水平;采用细胞增殖检测技术观察18β-甘草次酸对HPASMCs增殖的影响;采用流式细胞术检测18β-甘草次酸对HPASMCs的细胞周期的影响;采用Western blot技术检测18β-甘草次酸对HPASMCs中RhoA、ROCK1、ROCK2、p-MYPT1、t-MYPT1、Bax、Bcl-2、p27蛋白表达的影响;采用RT-qRCR法检测18β-甘草次酸对HPASMCs中RhoA、ROCK1、ROCK2mRNA表达的影响。结果:血流动力学指标检测结果表明,MCT组大鼠的mPAP、RVSP以及右心肥厚指数(RVHI)与正常组相比显著升高,给药不同剂量18β-甘草次酸(100、50mg/kg)治疗后,mPAP、RVSP、RVHI与模型组相比显著降低;H.E染色结果显示,与对照组相比,模型组大鼠肺中小动脉血管壁显著增厚,血管管腔面积狭窄,与模型组相比,18β-甘草次酸(100、50 mg/kg)能够显著改善大鼠肺中小动脉重构;Masson染色结果显示,MCT组大鼠肺组织胶原纤维化显著,肌纤维无规则排列,给予18β-甘草次酸(100、50 mg/kg)剂量治疗后可显著改善肺动脉高压大鼠肺组织中胶原纤维增生情况,肌纤维排列连续,趋于整齐;免疫组织化学染色结果显示,与正常对照组相比,模型组大鼠肺组织中α-SMA的表达水平显著增加,与模型组比较,给予18β-甘草次酸(100 mg/kg)治疗能降低大鼠肺组织中α-SMA的表达水平;Western blot结果显示,18β-甘草次酸(100 mg/kg)可以明显下调在肺动脉高压模型大鼠肺组织中过高表达的RhoA、ROCK1、ROCK2;细胞增殖实验结果显示,18β-甘草次酸(80、160μM)对HPASMCs的增殖具有抑制作用;流式细胞术实验结果表明18β-甘草次酸(80、160μM)具有阻滞HPASMCs细胞周期的作用;Western blot结果显示,18β-甘草次酸(160μM)可以显著降低在HPASMCs中高表达的RhoA、ROCK1、ROCK2、Bcl-2和过高表达的p-MYPT1/t-MYPT1比例,并且能够明显提高p27、Bax的蛋白表达;RT-qRCR结果显示,对比模型组,18β-甘草次酸(160μM)能够显著抑制HPASMCs中RhoA、ROCK1、ROCK2 mRNA表达。结论1.18β-甘草次酸对MCT诱导的肺动脉高压具有保护作用;2.18β-甘草次酸对PDGF-BB诱导的HPASMCs增殖具有抑制作用;3.18β-甘草次酸通过调节RhoA-ROCK信号传导途径改善肺动脉高压的发展。