脑血管内皮细胞中CSE生成的H2S对海马神经元缺氧性损伤的保护作用及其抑制RhoA-ROCK信号通路的机制

作     者：管千军 

作者单位：安徽医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：陈志武

授予年度：2023年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100204[医学-神经病学] 10[医学] 

主      题：硫化氢 共培养 RhoA-ROCK信号通路 氧糖剥夺再复氧损伤 

摘      要：背景:脑中风是一种有高发病率、高死亡率的急性脑血管病,目前已成为残疾和死亡的第二大原因。其主要发病机制是缺血再灌注,它可以诱导周围神经元产生明显的氧化损伤。硫化氢（Hydrogen sulfide,HS）是一种气体信号分子,在脑中风中起到至关重要的作用。内源性HS可以由胱硫醚-β-合成酶（cyste-beta-synthase,CBS）和胱硫醚-γ-裂解酶（cyste-gamma-lyase,CSE）催化半胱氨酸（cysteine,Cys）生成,此外3-巯基丙酮酸硫转移酶（3-mercaptopyruvate sulfur transferase,3-MST）可以联合半胱氨酸氨基转移酶（Cysteine aminotransferase,CAT）生成HS。CBS主要分布在中枢神经系统中,CSE主要分布在心血管系统中。3-MST在脑细胞、血管内皮细胞等中均有表达。因此内皮源性HS存在着CSE产生的HS（CSE-produced HS）和3-MST产生的HS（3-MST-produced HS）两种途径。RhoA-ROCK信号通路与心脑血管疾病的病理机理密切相关,是心脑血管系统的新靶点。Ras同源家族成员A（Ras homolog family member A,RhoA）是小分子鸟苷酸结合蛋白,ROCK是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,包括Rho相关卷曲螺旋形蛋白激酶1（Rho-associated coiled coil-containing protein kinase 1,ROCK）和Rho相关卷曲螺旋形蛋白激酶2（Rho-associated coiled coil-containing protein kinase 2,ROCK）两种亚型。研究表明抑制RhoA-ROCK信号通路可以保护脑神经细胞。本课题拟确定内皮细胞中CSE产生的HS是否对神经细胞缺氧损伤有保护作用,以及内皮细胞中CSE产生的HS与RhoA-ROCK信号通路之间的相互作用。目的:1.研究内皮细胞中CSE产生的HS对海马神经细胞OGD/R损伤有无保护作用。2.研究内皮细胞中CSE产生的HS对海马神经细胞OGD/R损伤的作用及与RhoA-ROCK信号通路的关系。方法:1.研究脑血管内皮细胞中CSE产生的HS对原代大鼠海马神经细胞OGD/R损伤的影响,使用L-Cys作为内源性HS供体。原代培养大鼠海马神经细胞和脑血管内皮细胞,再对两种细胞进行共培养。1.1两种细胞共培养后分为Control组、OGD/R组、OGD/R+Na HS(200μmol·L)组、OGD/R+L-Cys(50、100、200μmol·L)六组。Na HS作为阳性对照,确定L-Cys的合适剂量。通过试剂盒检测乳酸脱氢酶LDH、神经元特异性烯醇化酶NSE,通过CCK8法检测细胞活力,亚甲基蓝法检测HS含量。1.2两种细胞共培养后分为Control组、OGD/R组、OGD/R+L-Cys(200μmol·L)组、OGD/R+PPG组、OGD/R+L-Cys(200μmol·L)+PPG五组,通过试剂盒检测LDH、NSE,通过CCK8法检测细胞活力,亚甲基蓝法测定HS含量,Annexin-FITC/PI双染试剂盒检测细胞凋亡。2.研究脑血管内皮细胞中CSE产生的HS对原代海马神经细胞OGD/R损伤的作用及与RhoA-ROCK信号通路之间的关系。2.1两种细胞共培养后分为Control组、OGD/R组、OGD/R+L-Cys(200μmol·L)组、OGD/R+PPG组、OGD/R+L-Cys(200μmol·L)+PPG五组,使用RhoA、ROCK活性检测试剂盒检测RhoA、ROCK活性,采用Western blot法检测RhoA、ROCK蛋白表达;2.2原代培养CSE基因敲除及野生型小鼠脑血管内皮细胞（EC）和原代小鼠海马神经细胞（NC）,将细胞分成:（1）NC+EC;（2）NC+EC。每组均加入CBS抑制剂2-甲氧基-N-乙酰基苯胺（O-Acetoacetaniside,AOAA）、3-MST抑制剂天门冬氨酸（L-aspartic acid,L-Asp）、CSE底物L-半胱氨酸（L-cysteine,L-Cys）。亚甲基蓝法检测HS含量。Western blot检测RhoA、ROCK蛋白表达及对应的磷酸化蛋白表达。结果:1.1（1）与正常对照组比较,OGD/R组细胞活力明显降低,LDH和NSE水平明显升高（P0.01）,L-Cys(100、200μmol·L)组显著减弱OGD/R损伤导致的海马神经细胞活力的降低,使OGD/R损伤的神经细胞中LDH及NSE活性均下降。此外,给予阳性对照药Na HS(200μmol·L)与L-Cys(100、200μmol·L)有类似的作用效果。表明脑血管内皮细胞中