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Engineering crop phytophthora resistance by targeting pathogen-derived pi3p for enhanced catabolism

plant Communications 2023年第2期4卷 167-178页

作者： Kun Yang Qiang Yan Yi Wang Wenyi Zhu Xiaodan Wang Xiaobo Li Hao peng Yang Zhou Maofeng Jing Daolong Dou Key Laboratory of plant Immunity College of Plant ProtectionAcademy for Advanced Interdisciplinary StudiesNanjing Agricultural UniversityNanjing 210095China Institute of Industrial Crops Jiangsu Academy of Agricultural Sciences/Jiangsu Key Laboratory for Horticultural Crop Genetic ImprovementNanjing 210095China College of plant protection China Agricultural UniversityBeijing 100091China Crops Research Institute Guangdong Academy of Agricultural Sciences/Guangdong Provincial Key Laboratory of Crop Genetic ImprovementGuangdongGuangzhou 510640China Department of plant pathology Washington State UniversityPullmanWA 99164USA

phytophthora pathogens lead to numerous economically damaging plant diseases worldwide,including potato late blight caused by *** and soybean root rot caused by *** previous work showed that phytophthora pathogens may generate abundant phosphatidylinositol 3-phosphate(pi3p)to promote infection via direct association with RxLR ***,we designed a disease control strategy for metabolizing pathogen-derived pi3p by expressing secreted Arabidopsis thaliana phosphatidylinositol-4-phosphate 5-kinase 1(Atpip5K1),which can phosphorylate pi3p to pi(3,4)*** fused Atpip5K1 with the soybean pR1a signal peptide(Sp-pip5K1)to enable its secretion into the plant *** soybean and potato plants expressing Sp-pip5K1 showed substantially enhanced resistance to various *** and *** isolates,***-pip5K1 significantly reduced pi3p accumulation during *** and soybean *** or inhibition of pi3 kinases(pi3Ks)in *** compromised the resistance mediated by Sp-pip5K1,indicating that Sp-pip5K1 action requires a supply of pathogen-derived ***,we revealed that Sp-pip5K1 can interfere with the action of *** mediated by the RxLR effector *** novel disease control strategy has the potential to confer durable broad-spectrum phytophthora resistance in plants through a clear mechanism in which catabolism of pi3p interferes with RxLR effector actions.

关键词： Atpip5K1 phytophthora resistance pi3p RxLR effector transgenic plant

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Targeting of anti-microbial proteins to the hyphal surface amplifies protection of crop plants against phytophthora pathogens

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Molecular plant 2021年第8期14卷 1391-1403页

作者： Yang Zhou Kun Yang Qiang Yan Xiaodan Wang Ming Cheng Jierui Si Xue Xue Danyu Shen Maofeng Jing Brett M.Tyler Daolong Dou Key Laboratory of plant Immunity College of Plant ProtectionAcademy for Advanced Interdisciplinary StudiesNanjing Agricultural UniversityNanjing 210095China College of plant protection China Agricultural UniversityBeijing 100091China Center for Genome Research and Biocomputing and Department of Botany and plant pathology Oregon State UniversityCorvallisOR 97331USA

phytophthora pathogens are a persistent threat to the world's commercially important agricultural crops,including potato and *** strategies aim at reducing crop losses rely mostly on disease-resistance breeding and chemical pesticides,which can be frequently overcome by the rapid adaptive evolution of *** crops with intrinsic disease resista nee offer a promising alternative and con tinue to be ***,we explored phytophthora-derived pi3p(phosphatidylinositol 3-phosphate)as a novel control target,using proteins that bind this lipid to direct secreted anti-microbial peptides and proteins(AMps)to the surface of phytophthora *** transgenic Nicotiana benthamiana,soybean,and potato plants,significantly enhanced resistance to different pathogen isolates was achieved by expression of two AMps(GAFp1 or GAFp3 from the Chinese medicinal herb Gastrodia elata)fused with a pi3p-specific binding domain(FYVE).Using the soybean pathogen *** as an example,we demonstrated that the FYVE domain could boost the activities of GAFps in multiple independent assays,including those performed in vitro,in vivo,and in *** analysis of *** pi3K1 and pi3K2 genes of this pathogen confirmed that the enhanced activities of the targeted GAFps were correlated with pi3p levels in the ***,our study provides a new strategy that could be used to confer resistance not only to phytophthora pathogens in many plants but also potentially to many other kinds of plant pathogens with unique targets.

关键词： phytophthora pi3p AMps transgenic plants disease resistance

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刚地弓形虫TgpH1蛋白的重组表达及其与磷脂酰肌醇结合性的鉴定

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中国热带医学 2019年第3期19卷 201-204页

作者：贾永根闫爱霞黄敏君首都医科大学附属北京友谊医院北京热带医学研究所热带病防治北京市重点实验室北京100050

目的鉴定重组刚地弓形虫TgpH1蛋白与磷脂酰肌醇在体外的相互结合作用。方法提取刚地弓形虫总RNA,经RT-pCR扩增TgpH1基因编码序列。扩增产物连接入原核表达载体pGEX-4T-1中得到载体pGEX-TgpH1。同时通过基因定点突变获得载体pGEX-TgpH1R... 详细信息

目的鉴定重组刚地弓形虫TgpH1蛋白与磷脂酰肌醇在体外的相互结合作用。方法提取刚地弓形虫总RNA,经RT-pCR扩增TgpH1基因编码序列。扩增产物连接入原核表达载体pGEX-4T-1中得到载体pGEX-TgpH1。同时通过基因定点突变获得载体pGEX-TgpH1R37H。将测序正确的以上两种载体分别转化至大肠埃希菌(E. coli)BL21(DE3)并用IpTG诱导表达;SDS-pAGE结合考马斯亮蓝染色检测表达产物。重组蛋白经亲和层析纯化后,利用pip Strips脂质膜免疫印迹试验检测重组蛋白与不同磷脂酰肌醇的结合。结果经IpTG诱导4 h后,具有载体pGEX-TgpH1或pGEX-TgpH1R37H的菌株,在相对分子量接近40 kD处出现一条清晰的外源蛋白条带。纯化的重组GST-Tg?pH1蛋白能与pi3p和pi(3,5)p2特异性结合;而其相应的突变体GST-TgpH1R37H蛋白并不与膜上的任何磷脂酰肌醇分子相结合。结论本研究获得了弓形虫pH1全长重组蛋白,并鉴定了其与磷脂酰肌醇在体外的相互结合作用;同时表明TgpH1蛋白中R37位碱性氨基酸残基对其与磷脂酰肌醇的识别和结合过程中起着关键性的作用。本研究为进一步探索具有pH功能域的蛋白及与不同磷脂酰肌醇相互作用的分子机理研究奠定了基础。

关键词：刚地弓形虫 TgpH1 pi3p pi(3,5)p2

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辣椒疫霉效应分子RXLR23的表达、纯化与晶体结构初步研究

辣椒疫霉效应分子RXLR23的表达、纯化与晶体结构初步研究

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作者：张鑫山东农业大学

学位级别：硕士

辣椒疫霉(photophthora capsici)是一种具有很大危害性的蔬菜病原菌,侵染寄主范围广,包括辣椒、番茄、茄子、瓜类等多种茄科及葫芦科植物。随着这种病害的发生率和严重程度在逐年提高,人们对它的关注程度也在提高。近年来,辣椒疫病发生... 详细信息

辣椒疫霉(photophthora capsici)是一种具有很大危害性的蔬菜病原菌,侵染寄主范围广,包括辣椒、番茄、茄子、瓜类等多种茄科及葫芦科植物。随着这种病害的发生率和严重程度在逐年提高,人们对它的关注程度也在提高。近年来,辣椒疫病发生严重导致辣椒的减产,人们开始利用新的途径来研究辣椒疫霉的致病机制,随之越来越多的致病基因被发现。寄主和病原物之间的互作符合基因对基因假说(gene-for-gene hypothesis)。当抗病植物的抗病基因编码的蛋白识质别病原物的无毒基因编码的蛋白质时,植物的免疫反应被激活。无毒基因也被称为是效应基因。随着辣椒疫霉的基因组由美国能源部基因研究所(JGI)公布,许多效应基因被预测,但相关基因结构生物学还没有研究透彻。近年,卵菌效应因子转运机制成为病原物-寄主互作的热点问题,由于大部分的效应蛋白是胞内蛋白,而这些蛋白如何进入到植物体内,仍然还存在问题,本文试图通过研究转运机制以及植物抗病机制,为病害生物防治和选育抗病品种奠定重要基础。本研究通过生物信息学分析,从辣椒疫霉基因组中克隆到多个效应基因,成功通过体外原核表达和纯化获得高纯度和高浓度的蛋白质,最终得到一个效应分子蛋白晶体结构,其分辨率为3.2?,具体总结如下:1.通过生物信息学预测和分析,从辣椒疫霉的cDNA中克隆到50多个无毒基因,能够在原核表达系统成功表达和纯化的有3个基因,其氨基酸序列同源性很低,N端RxLR-deer基序保守及C端功能区存在很大差异,本研究主要以其中的RLXR23作为主要研究对象。2.重组蛋白质RXLR23通过亲和层析,离子交换层析和分子排阻层析纯化,得到稳定和高纯度蛋白质,由于RXLR23结构同源性30%,不能通过分子置换法解析结构,需要通过硒代蛋白来求解相位,硒代蛋白与native蛋白的表达和纯化方法一致。3.本研究通过蒸汽扩散法中的悬滴法和坐滴法得到初步蛋白晶体,利用悬滴法优化最终得到高质量的蛋白晶体用于X衍射,利用单波长反常散射法求解相位,最终解析RXLR23晶体结构,该蛋白以二聚化的形式行使其功能。4.目前报道的某些效应因子能够与寄主质膜上的3-磷酸磷脂酰肌醇(pi3p)结合,可使效应因子直接进入到寄主细胞内,本研究试图通过RXLR23与pi3p的结合,在三维空间结构中解释效应分子与之结合的位点,利用蛋白表达纯化技术和晶体学技术,最终得到复合物晶体。5.在晶体优化过程中,初始得到的晶体质量衍射分辨率只有8?左右,通过截短,脱水,更换防冻液等方法,成功将分辨率提高到3.2?。本研究初步得到RXLR23蛋白的晶体结构和与pi3p复合物的晶体,可以在蛋白质三维空间结构上观察效应分子如何行使其相关生物学功能,为病原物与寄主间的互作提供重要理论依据。

关键词：辣椒疫霉 RXLR23 pi3p 复合物晶体结构亚细胞定位

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