辣椒疫霉效应分子RXLR23的表达、纯化与晶体结构初步研究

作     者：张鑫 

作者单位：山东农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张修国

授予年度：2015年

学科分类：09[农学] 0904[农学-植物保护] 090401[农学-植物病理学] 090402[农学-农业昆虫与害虫防治] 

主      题：辣椒疫霉 RXLR23 PI3P 复合物 晶体结构 亚细胞定位 

摘      要：辣椒疫霉(Photophthora capsici)是一种具有很大危害性的蔬菜病原菌,侵染寄主范围广,包括辣椒、番茄、茄子、瓜类等多种茄科及葫芦科植物。随着这种病害的发生率和严重程度在逐年提高,人们对它的关注程度也在提高。近年来,辣椒疫病发生严重导致辣椒的减产,人们开始利用新的途径来研究辣椒疫霉的致病机制,随之越来越多的致病基因被发现。寄主和病原物之间的互作符合基因对基因假说(gene-for-gene hypothesis)。当抗病植物的抗病基因编码的蛋白识质别病原物的无毒基因编码的蛋白质时,植物的免疫反应被激活。无毒基因也被称为是效应基因。随着辣椒疫霉的基因组由美国能源部基因研究所(JGI)公布,许多效应基因被预测,但相关基因结构生物学还没有研究透彻。近年,卵菌效应因子转运机制成为病原物-寄主互作的热点问题,由于大部分的效应蛋白是胞内蛋白,而这些蛋白如何进入到植物体内,仍然还存在问题,本文试图通过研究转运机制以及植物抗病机制,为病害生物防治和选育抗病品种奠定重要基础。本研究通过生物信息学分析,从辣椒疫霉基因组中克隆到多个效应基因,成功通过体外原核表达和纯化获得高纯度和高浓度的蛋白质,最终得到一个效应分子蛋白晶体结构,其分辨率为3.2?,具体总结如下:1.通过生物信息学预测和分析,从辣椒疫霉的cDNA中克隆到50多个无毒基因,能够在原核表达系统成功表达和纯化的有3个基因,其氨基酸序列同源性很低,N端RxLR-deer基序保守及C端功能区存在很大差异,本研究主要以其中的RLXR23作为主要研究对象。2.重组蛋白质RXLR23通过亲和层析,离子交换层析和分子排阻层析纯化,得到稳定和高纯度蛋白质,由于RXLR23结构同源性30%,不能通过分子置换法解析结构,需要通过硒代蛋白来求解相位,硒代蛋白与native蛋白的表达和纯化方法一致。3.本研究通过蒸汽扩散法中的悬滴法和坐滴法得到初步蛋白晶体,利用悬滴法优化最终得到高质量的蛋白晶体用于X衍射,利用单波长反常散射法求解相位,最终解析RXLR23晶体结构,该蛋白以二聚化的形式行使其功能。4.目前报道的某些效应因子能够与寄主质膜上的3-磷酸磷脂酰肌醇(PI3P)结合,可使效应因子直接进入到寄主细胞内,本研究试图通过RXLR23与PI3P的结合,在三维空间结构中解释效应分子与之结合的位点,利用蛋白表达纯化技术和晶体学技术,最终得到复合物晶体。5.在晶体优化过程中,初始得到的晶体质量衍射分辨率只有8?左右,通过截短,脱水,更换防冻液等方法,成功将分辨率提高到3.2?。本研究初步得到RXLR23蛋白的晶体结构和与PI3P复合物的晶体,可以在蛋白质三维空间结构上观察效应分子如何行使其相关生物学功能,为病原物与寄主间的互作提供重要理论依据。