刚地弓形虫TgPH1蛋白的重组表达及其与磷脂酰肌醇结合性的鉴定

作     者：贾永根 闫爱霞 黄敏君 JIA Yonggen;YAN Aixia;HUANG Minjun

作者机构：首都医科大学附属北京友谊医院北京热带医学研究所热带病防治北京市重点实验室北京100050 

出 版 物：《中国热带医学》 (China Tropical Medicine)

年 卷 期：2019年第19卷第3期

页      面：201-204页

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100103[医学-病原生物学] 10[医学] 

基　　金：北京市自然科学基金(No.7182023) 首都医科大学附属北京友谊医院科研启动基金资助项目(No.yyqdkt2017-3) 

主　　题：刚地弓形虫 TgPH1 PI3P PI(3,5)P2 

摘      要：目的鉴定重组刚地弓形虫TgPH1蛋白与磷脂酰肌醇在体外的相互结合作用。方法提取刚地弓形虫总RNA,经RT-PCR扩增TgPH1基因编码序列。扩增产物连接入原核表达载体pGEX-4T-1中得到载体pGEX-TgPH1。同时通过基因定点突变获得载体pGEX-TgPH1R37H。将测序正确的以上两种载体分别转化至大肠埃希菌(E. coli)BL21(DE3)并用IPTG诱导表达;SDS-PAGE结合考马斯亮蓝染色检测表达产物。重组蛋白经亲和层析纯化后,利用PIP Strips脂质膜免疫印迹试验检测重组蛋白与不同磷脂酰肌醇的结合。结果经IPTG诱导4 h后,具有载体pGEX-TgPH1或pGEX-TgPH1R37H的菌株,在相对分子量接近40 kD处出现一条清晰的外源蛋白条带。纯化的重组GST-Tg?PH1蛋白能与PI3P和PI(3,5)P2特异性结合;而其相应的突变体GST-TgPH1R37H蛋白并不与膜上的任何磷脂酰肌醇分子相结合。结论本研究获得了弓形虫PH1全长重组蛋白,并鉴定了其与磷脂酰肌醇在体外的相互结合作用;同时表明TgPH1蛋白中R37位碱性氨基酸残基对其与磷脂酰肌醇的识别和结合过程中起着关键性的作用。本研究为进一步探索具有PH功能域的蛋白及与不同磷脂酰肌醇相互作用的分子机理研究奠定了基础。