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异绿原酸A通过perk信号通路缓解小反刍兽疫病毒诱导的内质网应激

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中国兽医学报 2024年第7期44卷 1408-1417页

作者：穆芸孙甜甜邝永胜袁书艺刘艳芬陈绍红刘铀郭富城广东海洋大学滨海农业学院广东湛江524088 广东海洋大学食品科技学院广东湛江524088

病毒感染可诱导宿主细胞产生内质网应激(ERS)与未折叠蛋白反应(UPR),导致内质网稳态失衡。为了探讨异绿原酸A(IAA)在调节小反刍兽疫病毒(PPRV)诱导的ERS和UPR中的作用机制,采用MTT试验、间接免疫荧光试验和Western blot评估IAA的抗PPRV... 详细信息

病毒感染可诱导宿主细胞产生内质网应激(ERS)与未折叠蛋白反应(UPR),导致内质网稳态失衡。为了探讨异绿原酸A(IAA)在调节小反刍兽疫病毒(PPRV)诱导的ERS和UPR中的作用机制,采用MTT试验、间接免疫荧光试验和Western blot评估IAA的抗PPRV活性;采用Western blot和实时荧光定量PCR观察IAA对PPRV诱导的ERS及perk信号通路的影响。结果表明,IAA能显著抑制PPRV在LDG-2细胞中的复制及病毒诱导的细胞病变,显著提高病毒感染细胞的存活率;与病毒对照组相比,IAA处理的PPRV感染细胞中GRP78和PPRV表达水平、p-perk/perk和p-eIF2α/eIF2α比值均显著降低;GADD153表达水平则在病毒感染24、36h显著降低,在48、60h显著升高。用4-PBA阻断PPRV诱导的ERS,IAA和4-PBA+IAA处理PPRV感染细胞中GRP78、PPRV-N蛋白、GADD153的表达水平及p-eIF2α/eIF2α、p-perk/perk比值均显著降低。由此可见,IAA可通过抑制perkeIF2α-GADD153信号通路的激活缓解PPRV感染诱导的ERS,从而抑制病毒在宿主细胞的复制。

关键词：异绿原酸A 小反刍兽疫病毒(PPRV) 内质网应激(ERS) perk信号通路

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香砂六君子汤对脾虚高脂血症大鼠内质网应激perk信号通路的影响

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中华中医药学刊 2023年第9期41卷 75-78,I0023页

作者：杜莹贾连群冷雪王杰杨关林辽宁中医药大学中医脏象理论及应用教育部重点实验室辽宁沈阳110847

目的探讨香砂六君子汤对脾虚高脂血症大鼠内质网应激蛋白激酶R样内质网激酶(protein kinase R-like ER kinase,perk)信号通路的影响。方法SD大鼠随机分为4组,即正常对照组、脾虚高脂组、香砂六君子汤组和辛伐他汀组,后3组采用饮食不节... 详细信息

目的探讨香砂六君子汤对脾虚高脂血症大鼠内质网应激蛋白激酶R样内质网激酶(protein kinase R-like ER kinase,perk)信号通路的影响。方法SD大鼠随机分为4组,即正常对照组、脾虚高脂组、香砂六君子汤组和辛伐他汀组,后3组采用饮食不节加力竭游泳的复合方法造模15 d后,正常组喂饲基础饲料,其余3组喂饲高脂饲料。12周后,分别给予相对剂量药物和生理盐水。4周后,检测各组大鼠血脂含量、D-木糖排泄率,油红O染色观察肝脏脂质沉积情况,实时荧光定量PCR及Western blot法检测大鼠肝脏葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78 kD,GRP78)、perk和活化转录因子4(the activating transcription factor 6,ATF4)基因及蛋白表达。结果与正常对照组比较,脾虚高脂组大鼠血清脂质异常,表现为总胆固醇(cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、低密度脂蛋白胆固醇酯(low density lipoprotein-cholesterol,LDL-C)明显升高,高密度脂蛋白胆固醇酯(high density lipoprotein-cholesterol,HDL-C)明显降低,尿D-木糖排泄率明显降低;肝脏脂质沉积显著,可见明显脂滴;肝脏GRP78、perk和ATF4 mRNA水平及蛋白表达水平显著升高。与脾虚高脂组比较,香砂六君子汤组和辛伐他汀组大鼠血清TC、TG、LDL-C明显降低,HDL-C明显升高,尿D-木糖排泄率明显升高;其肝脏脂质沉积情况有明显改善,脂滴不同程度减轻;肝脏GRP78、perk和ATF4 mRNA水平及蛋白表达水平明显降低。结论香砂六君子汤可能通过调控内网应激perk信号通路来纠正脾虚脂质紊乱的状态。

关键词：香砂六君子汤脾虚高脂血症内质网应激 perk信号通路

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热应激通过内质网应激介导perk信号通路调控奶牛乳腺上皮细胞凋亡的机制研究

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热应激通过内质网应激介导PERK信号通路调控奶牛乳腺上皮细胞凋亡...

作者：胡海涛安徽农业大学

学位级别：硕士

热应激是一直以来制约我国奶业发展的一个重要问题,热应激对奶牛造成多种危害,严重影响奶牛生产性能。内质网应激是机体遭遇环境刺激时的一种保护性反应,已有研究证实,热应激会导致奶牛乳腺上皮细胞发生热休克反应,并且引发细胞凋亡,但... 详细信息

热应激是一直以来制约我国奶业发展的一个重要问题,热应激对奶牛造成多种危害,严重影响奶牛生产性能。内质网应激是机体遭遇环境刺激时的一种保护性反应,已有研究证实,热应激会导致奶牛乳腺上皮细胞发生热休克反应,并且引发细胞凋亡,但是导致奶牛乳腺上皮细胞凋亡的机制是否与热应激条件下奶牛乳腺上皮细胞中的内质网应激有关亟需进一步研究。本试验的目的在于通过建立奶牛乳腺上皮细胞热应激模型,探究热应激条件下内质网应激调控奶牛乳腺上皮细胞发生凋亡的机制。首先将混合生长的奶牛成纤维细胞和奶牛乳腺上皮细胞分离培养,得到纯化的奶牛乳腺上皮细胞后利用免疫荧光法进行奶牛乳腺上皮细胞鉴定,并建立奶牛乳腺上皮细胞热应激模型,以热休克反应和内质网应激相关的标志基因和细胞钙离子含量作为判断细胞发生热休克反应和内质网应激的判定指标。随后用内质网应激抑制剂4-PBA处理热应激奶牛乳腺上皮细胞,利用q RT-PCR和流式细胞仪检测内质网应激抑制剂4-PBA对热应激奶牛乳腺上皮细胞凋亡的缓解作用。采用内质网应激诱导剂Brefeldin A建立奶牛乳腺上皮细胞内质网应激模型,探究当抑制内质网应激条件下未折叠蛋白反应(UPR)中的perk信号通路之后对奶牛乳腺上皮细胞凋亡相关基因的表达量、细胞活力及细胞凋亡率的影响。结果显示,本试验成功获得纯化的奶牛乳腺上皮细胞。通过建立奶牛乳腺上皮细胞热应激模型发现,41℃热处理2 h和3 h会诱导奶牛乳腺上皮细胞发生内质网应激,内质网应激相关的标记基因GRP78、perk、XBP1 m RNA的表达量较37℃正常培养条件下显著升高(Pperk和e IF2αm RNA的表达量较空白对照组显著升高(Pperk信号通路后,与Brefeldin A处理组相比,细胞中perk、ATF4和CHOP m RNA表达量显著降低(Pperk信号通路可缓解内质网应激导致的细胞凋亡,为热应激导致的奶牛乳腺上皮细胞凋亡的机制研究提供了新的理论依据。

关键词：奶牛乳腺上皮细胞热应激内质网应激 perk信号通路细胞凋亡

SREBP1c调节人perk蛋白表达并通过perk信号通路影响骨肉瘤细胞增殖、凋亡和自噬

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SREBP1c调节人PERK蛋白表达并通过PERK信号通路影响骨肉瘤细胞增...

作者：胡勤重庆医科大学

学位级别：硕士

目的探讨固醇调节元件结合蛋白1c(sterol regulating element binding protein 1c,SREBP1c)是否与人蛋白激酶样内质网激酶(protein kinase-like endoplasmic reticulum kinase,perk)基因启动子结合,并通过调控perk基因转录与表达,影响骨肉瘤细胞saos2和RCS发生增殖、凋亡和自噬的可能机制。方法构建人perk基因启动子全长及一系列截短体报告基因载体,与内参质粒p RL-SV40和pc DNA3.1-SREBP1c、pc DNA3.1-SREBP1cm共转染骨肉瘤细胞后检测荧光素酶活性;运用Ch IP和EMSA方法检测SREBP1c与perk启动子的结合作用;应用p WPT-GFP慢病毒载体系统,构建并包装慢病毒SREBP1c、SREBP1cm和perk。感染细胞后,通过RT-PCR和蛋白质印迹法检测骨肉瘤细胞中perk m RNA和蛋白的表达。应用衣霉素(Tunicamycin,TM)建立内质网应激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)模型,检测和探讨ERS状态下,SREBP1c、SREBP1cm与perk对骨肉瘤细胞的增殖、凋亡和自噬的调控作用及可能的分子机制。结果pc DNA3.1-SREBP1c、pc DNA3.1-SREBP1cm上调perk启动子的活性;Ch IP和EMSA证明转录因子SREBP1c直接与perk基因启动子区域结合并调节perk的转录与表达;成功构建并获得慢病毒SREBP1c、SREBP1cm颗粒;成功建立内质网应激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)模型;在ERS状态下,SREBP1c、SREBP1cm分组感染后,与对照组GFP相比较,SREBP1c、SREBP1cm可以不同程度的促进骨肉瘤细胞perk及p-perk的表达(Pperk在未经TM诱导的情况下同样可以诱导内质网应激的发生;在ERS状态下,过表达SREBP1c、SREBP1cm和perk都可以抑制骨肉瘤细胞的增殖、促进其凋亡和自噬;其中SREBP1c/1cm可以通过上调perk的表达及磷酸化增强perk对细胞增殖的抑制作用、促进perk介导的细胞凋亡和细胞自噬。而在加入perk信号通路抑制剂GSK2606414后,可以有效逆转SREBP1cm对perk各项生物学功能的促进作用,即:GSK2606414有效逆转SREBP1cm促进perk对细胞增殖的抑制作用、促进perk介导的细胞凋亡和细胞自噬,证明SREBP1c调节细胞增殖、凋亡和自噬均是通过上调perk表达及磷酸化激活相应的信号通路来实现的。结论SREBP1c转录因子通过直接与perk基因启动子结合调节perk基因的转录与表达;SREBP1c/1cm增强perk对细胞增殖的抑制作用,促进perk介导的凋亡和自噬;SREBP1c/1cm的这一作用依赖于perk信号通路。

关键词： perk SREBP1c perk信号通路内质网应激骨肉瘤细胞自噬

六味补气胶囊对COPD模型大鼠膈肌疲劳的干预作用及perk信号通路的影响

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六味补气胶囊对COPD模型大鼠膈肌疲劳的干预作用及PERK信号通路的...

作者：郭丽青安徽中医药大学

学位级别：硕士

1目的研究六味补气胶囊对COPD模型大鼠膈肌疲劳的干预作用及perk信号通路的影响2方法选取雄性SPF级SD大鼠100只,随机选取15只作为正常对照组,其余大鼠采取气管滴入脂多糖加烟熏制作COPD模型,造模周期12周。模型成功标准依据大鼠肺功能... 详细信息

1目的研究六味补气胶囊对COPD模型大鼠膈肌疲劳的干预作用及perk信号通路的影响2方法选取雄性SPF级SD大鼠100只,随机选取15只作为正常对照组,其余大鼠采取气管滴入脂多糖加烟熏制作COPD模型,造模周期12周。模型成功标准依据大鼠肺功能改变和支气管、肺组织病理学变化。造模成功后将大鼠分为5组:模型组、氨茶碱组及六味补气胶囊低、中、高剂量组。正常对照组和模型组灌服生理盐水10ml/kg·d,氨茶碱组灌服氨茶碱混悬液2.3mg/kg·d(相当于成人常规临床用量的10倍),六味补气胶囊低、中、高剂量组采用六味补气胶囊混悬液灌服,剂量分别为0.265g/kg·d、0.53g/kg·d、1.06g/kg·d(相当于成人常规临床用量的5倍、10倍、20倍),以上给药均于造模第9周的第1天开始,每日2次,连续给药12周。治疗结束后测定各组大鼠肺功能;取出整块肺组织置于4%多聚甲醛溶液固定,HE染色检测支气管、肺组织及膈肌组织病理学变化;Western-blot法检测膈肌组织中GRP78、CRT、perk、eIF2α、ATF4和CHOP蛋白水平;RT-qPCR法检测膈肌组织中GRP78、CRT、perk、eIF2α、ATF4和CHOP mRNA水平。3结果3.1各组大鼠肺功能变化与正常对照组相比,模型组大鼠肺功能指数FVC、FEV0.3、FEV0.3/FVC、PEF明显降低(P0.05);六味补气胶囊高剂量组、六味补气胶囊中剂量组与六味补气胶囊低剂量组、氨茶碱组之间比较,差异具有统计学意义(P0.05)。3.2各组大鼠支气管、肺组织及膈肌组织病理学变化支气管、肺组织:正常对照组大鼠支气管粘膜上皮完整,纤毛排列整齐、明显可见;肺泡壁无明显增厚,肺泡腔干净、匀称。模型组大鼠普遍存在支气管纤毛上皮破损、坏死、脱落、纤毛减少、粘连和倒伏,杯状细胞增生,支气管壁有大量的炎性细胞浸润,部分支气管平滑肌明显增厚,管腔内有炎性细胞及粘液分泌物,呈慢性支气管炎病理学改变。肺泡结构大小不一,呼吸性细支气管及肺泡管、肺泡囊扩张,部分扩张呈不规则气腔;部分肺泡相互融合形成肺大泡,呈肺气肿病理学改变。氨茶碱组和六味补气胶囊各剂量组大鼠支气管、肺组织病理学变化有不同程度改善,支气管纤毛黏连、倒伏、缺失、变性坏死等改变减轻,杯状细胞减少,支气管壁炎性细胞浸润减轻,支气管平滑肌变薄,管腔内炎性细胞及粘液分泌物减少。肺泡腔减小,肺大泡减少。尤以六味补气胶囊高、中剂量组改变更为显著,呈剂量依赖性。膈肌组织:正常对照组大鼠膈肌纵切面肌纤维排列整齐、紧密,间质细胞少,肌横纹规则;横切面肌纤维大小一致。模型组大鼠膈肌纵切面肌纤维大小不一,部分肌纤维扭曲,肌横纹紊乱,肌间结缔组织增多,细胞数增加,横截面部分肌纤维不完整,肌纤维间隙增大。氨茶碱组和六味补气胶囊各剂量组大鼠膈肌纤维病理学变化有不同程度改善,纵切面肌纤维排列相对整齐,肌横纹相对规则,肌间结缔组织减少,细胞数减少;横截面肌纤维相对完整,肌纤维间隙减小。尤以六味补气胶囊高、中剂量组改变更为显著,呈剂量依赖性。3.3各组大鼠膈肌组织中GRP78、CRT、perk、eIF2α、ATF4、CHOP表达的变化与正常对照组相比,模型组大鼠膈肌组织中GRP78、CRT、perk、eIFf2α、ATF4、CHOP蛋白表达量明显升高;与模型组相比,六味补气胶囊各剂量组及氨茶碱组大鼠膈肌组织中GRP78、CRT、perk、eIFf2α、ATF4、CHOP蛋白表达量都明显降低;各治疗组之间比较,六味补气胶囊高剂量组GRP78、CRT、perk、eIFf2α、ATF4、CHOP蛋白表达量最低,其次为中剂量组、氨茶碱组、低剂量组。3.4各组大鼠膈肌组织中GRP78、CRT、perk、eIF2α、ATF4和CHOP mRNA水平的变化与正常对照组相比,模型组大鼠膈肌组织中GRP78mRNA、CRTmRNA、perkmRNA、eIFf2αmRNA、ATF4mRNA、CHOPmRNA均明显升高(PperkmRNA、eIFf2αmRNA、ATF4mRNA、CHOPmRNA均显著降低(P<0.01),其中,以六味补气胶囊高剂量组降低最为明显;六味补气胶囊高剂量组与六味补气胶囊中剂量、低剂量组比较,差异具有统计学意义(P<0.01),六味补气胶囊高剂量组与氨茶碱组比较无

关键词：六味补气胶囊慢性阻塞性肺疾病膈肌疲劳内质网应激 perk信号通路

基于内质网应激perk信号通路探讨芍药汤干预UC的机制

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基于内质网应激PERK信号通路探讨芍药汤干预UC的机制

作者：杜英杰湖南中医药大学

学位级别：硕士

目的:通过采用RT-PCR和Western-blot法检测蛋白激酶R样内质网激酶(perk)、真核翻译起始因子2a(e IF2a)基因转录以及蛋白的表达水平,探讨芍药汤治疗溃疡性结肠炎(UC)的作用机制。方法:通过湿热环境、高脂高糖饮食建立胃肠湿热模型后将85... 详细信息

目的:通过采用RT-PCR和Western-blot法检测蛋白激酶R样内质网激酶(perk)、真核翻译起始因子2a(e IF2a)基因转录以及蛋白的表达水平,探讨芍药汤治疗溃疡性结肠炎(UC)的作用机制。方法:通过湿热环境、高脂高糖饮食建立胃肠湿热模型后将85只SD大鼠随机抽取22只作为空白组(Blank组),其余大鼠用TNBS法在胃肠湿热模型的基础上建立UC大鼠模型,除去死亡大鼠后,分为造模组(Model组)20只、柳氮磺吡啶组(SASP组)19只、芍药汤组(SYT组)20只。Blank组、Model组利用生理盐水灌胃,SASP组利用柳氮磺吡啶灌胃,SYT组利用芍药汤灌胃;在灌胃7天、14天两个时项点,各组大鼠分别进行疾病活动指数(DAI)评分,同时各组随机处死1/2大鼠进行结肠粘膜损伤指数(CMDI)评分,随后剖取结肠组织病变最明显处样本,用于检测perk、e IF2a基因和蛋白的表达。结果:一般情况,与造模前相比,造模后的Blank组大鼠状态轻度变差,Model组、SASP组SYT组大鼠状态相似并且严重变差。随着实验的进行Blank组大鼠状态恢复至造模前,Model组大鼠状态无明显改善,SASP组大鼠状态好转,SYT组大鼠状态改善明显。大鼠DAI评分:在灌胃7天时Model组、SASP组、SYT组均较Blank组明显增高(p0.05)且低于Model组(p0.05),SYT组在14天时明显低于7天时(p0.05),但均高于SYT组(p0.05),但均高于SYT组(p0.05)。p-perk蛋白的相对表达:灌胃7天时,Blank组较Model组低(p>0.05),Blank组较SPSA组低(p>0.05),Blank组和SYT组无差异(p>0.05),Model组和SASP组无差异(p>0.05),Model组明显高于SYT组(p0.05)。14天时,Blank组和SYT组无差异(p>0.05),Model组和SASP组无差异(p>0.05),Model组和SASP组明显高于Blank组和SYT组(p0.05)。p-e IF2a蛋白的相对表达:灌胃7天时Blank组均较Model组、SASP组、SYT组低(p0.05)。Model组和SASP组均较SYT组高(p0.05),Model组和SASP组均较无明显差异(p>0.05)。Model组和SASP组均较SYT组高(p0.05),Model组的在灌胃7天时要高于灌胃14天时(pperk m RNA表达:灌胃7天时,Blank组较Model组、SASP组、SYT组均低(p0.01),Model组、SASP组无明显差异(P>0.01),Model组、SASP组均较SYT组均高(p0.01),SASP组和SYT组在7天较14天时高(p0.01)Model组较SYT

关键词：实验研究 perk信号通路溃疡性结肠炎芍药汤

“二仙”通过抑制内质网应激perk信号通路缓解MIRI的研究

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“二仙”通过抑制内质网应激PERK信号通路缓解MIRI的研究

作者：陈雨晴延安大学

学位级别：硕士

目的:探究“二仙”(仙茅、仙灵脾)是否通过抑制内质网应激perk信号通路减轻SD大鼠心肌缺血再灌注损伤。方法:1.I/R模型建立:雄性SD大鼠54只,体重分布在240±20g,随机分为6组:对照组(Control组)、缺血再灌注组(I/R组)、低剂量组(2.5g/Kg... 详细信息

目的:探究“二仙”(仙茅、仙灵脾)是否通过抑制内质网应激perk信号通路减轻SD大鼠心肌缺血再灌注损伤。方法:1.I/R模型建立:雄性SD大鼠54只,体重分布在240±20g,随机分为6组:对照组(Control组)、缺血再灌注组(I/R组)、低剂量组(2.5g/Kg)、中剂量组(5g/Kg)、高剂量组(10g/Kg)、高剂量组+CCT020312(perk信号通路激动剂)。不间断灌胃14天,CCT020312于造模前1小时以2mg/kg腹腔注射给药。末次给药2小时后造模,在心脏左前降支(LAD)处结扎,心电图显示ST段升高即造模成功,30分钟后松开结扎线,再灌注2小时。2.取样:造模成功后腹主动脉取血离心,心肌组织匀浆,-80℃冻存备用。3.实验方法:模型建造成功后,采用TTC(2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride)法检测各组大鼠心肌梗死区面积大小、ELISA法(Enzyme linked immunosorbent assay)检测各组大鼠心损标记物CK-MB、c Tn T浓度、HE染色(Hematoxylin-eosin staining)对比各组大鼠心脏组织病理损伤严重程度、TUNEL法测定各组大鼠心肌细胞凋亡、WB检测I/R大鼠GRP78、perk、P-perk、e IF2a、p-e IF2a、CHOP内质网应激及凋亡相关蛋白表达情况。结果:1.“二仙”可减少I/R大鼠心肌梗死面积:与Control组相比,I/R组心肌梗死面积增大,各剂量组“二仙”药物预处理后心肌梗死面积减小,随着用药剂量的增加,梗死面积不断缩小。CCT020312+高剂量组心肌梗死面积较高剂量组增大。2.“二仙”可降低I/R大鼠心损标记物CK-MB、c Tn T浓度:与Control组相比,I/R组CK-MB、c Tn T浓度显著升高,低、中、高剂量的药物预处理后CK-MB、c Tn T浓度显著降低,同时CCT020312+高剂量组CKMB、c Tn T浓度较高剂量组增高。3.“二仙”可减轻I/R大鼠心肌组织病理损伤:与对照组相比,I/R组出现明显的病理损伤,心肌纤维出现明显断裂,呈波浪状松解,边缘模糊,可见炎细胞浸润,细胞核水肿,低、中、高剂量的药物预处理后心肌损伤严重程度较前明显降低,而CCT020312+高剂量组心肌细胞损伤较高剂量组加重。4.“二仙”可降低I/R大鼠心肌细胞凋亡率:I/R组凋亡的心肌细胞明显增多,经低、中、高剂量的药物灌胃后,凋亡细胞减少,且随着药物剂量的增加,细胞凋亡率下降的更加明显。CCT020312+高剂量组心肌细胞凋亡率较高剂量组升高。5.“二仙”可抑制I/R大鼠GRP78、perk、P-perk、e IF2a、p-e IF2a、CHOP内质网应激相关蛋白及凋亡蛋白表达:遭受缺血再灌注刺激后,内质网应激通路激活,I/R组相关蛋白表达量明显升高,低、中、高剂量药物预处理可抑制内质网应激通路的过度激活,降低内质网应激相关蛋白及凋亡蛋白的表达。CCT020312+高剂量组特异性激活了perk信号通路,相关蛋白表达量增多。结论:1.“二仙”药物预处理可抑制I/R大鼠的心肌细胞内质网应激,减少细胞凋亡,缓解MIRI;2.“二仙”保护I/R大鼠免受缺血再灌注损伤的作用与内质网应激perk信号通路有关。

关键词： “二仙” 心肌缺血再灌注损伤内质网应激 perk信号通路细胞凋亡

冬眠不同时期达乌尔黄鼠骨路肌中内盾网应激介导的perk信号通路的作用研究

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冬眠不同时期达乌尔黄鼠骨路肌中内盾网应激介导的PERK信号通路的...

作者：张洁西北大学

学位级别：硕士

研究背景及目的:非冬眠动物(大鼠、小鼠、人类等)在机械去负荷、禁食、去神经、缺血再灌注等应激状态下,骨骼肌形态、功能均会受到损伤,出现骨骼肌萎缩。而冬眠动物,如达乌尔黄鼠(Spermophilus dauricus),在冬眠过程中,同处于去神经、... 详细信息

研究背景及目的:非冬眠动物(大鼠、小鼠、人类等)在机械去负荷、禁食、去神经、缺血再灌注等应激状态下,骨骼肌形态、功能均会受到损伤,出现骨骼肌萎缩。而冬眠动物,如达乌尔黄鼠(Spermophilus dauricus),在冬眠过程中,同处于去神经、禁食、后肢去负荷/不活动状态,且“冬眠-阵间觉醒”循环中伴随着“缺血再灌注”的应激挑战,其骨骼肌却未出现明显萎缩,对冬眠期间的恶劣环境展现出了极强的适应能力。因此,探究冬眠动物冬眠期间独特的骨骼肌适应和质量维持机制,是目前动物生理学领域一大难题。已有证据表明,内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ER stress)诱发的细胞自我调控机制-未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)在骨骼肌对外界刺激的响应过程中发挥着重要的调控作用。ER stress是机体处于不良环境时,内质网稳态失衡引起的一种应激反应。当ER stress产生时,内质网中未折叠蛋白数目剧增,这时葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78,GRP78)会从内质网跨膜蛋白,如蛋白激酶样内质网激酶(protein kinase-like ER kinase,perk)、活化转录因子6(activating transcription factor 6,ATF6)、肌醇需酶1(inositol-requiring enzyme1,IRE1)上迅速解离下来,参与内质网腔中未折叠蛋白的正确折叠;与此同时,UPR三条信号通路启动,通过调控促生存或促凋亡相关基因的表达,促进细胞生存或死亡。因此,为了探究ER stress介导的UPR是否参与了冬眠动物冬眠期间骨骼肌的适应及维持机制,本研究以达乌尔黄鼠为实验对象,对冬眠不同时期后肢不同类型不同部位的骨骼肌中ER stress的产生与否及其介导的UPR中perk信号通路相关指标的变化情况进行了检测。研究方法:使用红外热成像仪对黄鼠体温进行监测,观察并统计不同性别、体重对黄鼠冬眠阵睡眠时长的影响;以夏季活跃组(summer active group,SA)、冬眠前组(pre-hibernation group,PRE)、浅冬眠组(early torpor group,ET)、深冬眠组(late torpor group,LT)、阵间觉醒组(interbout arousal group,IBA)及出眠组(post-hibernation group,POST)六组黄鼠的跖肌(plantaris longus,PL)、腓肠肌(gastrocnemius,GAS)及半腱肌(semitendinosus,ST)为实验对象,采用冰冻切片、免疫荧光组织化学技术对肌纤维分型比例、肌纤维横截面积(muscle fiber cross section area,CSA)进行测定;Western blot技术对ER stress靶标分子GRP78,perk信号通路相关蛋白(p-perk,p-eIF2α,ATF4)的蛋白表达进行检测;实时荧光定量PCR技术,对grp78及atf4的mRNA相对表达量进行测定;TUNEL染色法对细胞凋亡进行了检测。研究结果:1.性别与体重对达乌尔黄鼠冬眠阵睡眠时长的影响不同性别之间和不同体重范围之间,达乌尔黄鼠冬眠阵睡眠时长无明显差异,均维持在7天左右。2.不同时期达乌尔黄鼠骨骼肌形态指标的变化(1)与SA和PRE组相比,黄鼠体重在冬眠阵(ET,LT,IBA)及POST组均出现显著降低。骨骼肌肌肉湿重(muscle wet weight,MWW)、肌重体重比(muscle wet weight/body weight,MWW/BW)的统计结果显示,与SA组相比,POST组PL,GAS和ST的MWW分别下降了11%,13%(P<0.05)和20%(P<0.001);但与PRE组相比,POST组PL,GAS和ST的MWW/BW分别升高了28%(P<0.001),28%(P<0.01)和16%(P<0.01)。(2)与SA和PRE组相比,冬眠中三种骨骼肌的慢型肌纤维比例略有升高,POST组又基本恢复至冬眠前水平。与SA相比,POST组PL的慢型和快型CSA分别减小了12%和13%(P<0.05);GAS的慢型和快型CSA分别下降了13%和13%(P<0.05);ST的慢型和快型CSA分别下降了12%(P<0.05)和17%(P<0.01)。3.不同时期达乌尔黄鼠骨骼肌中ER stress靶标分子GRP78的蛋白与mRNA表达变化(1)蛋白水平:与SA和PRE组相比,LT组三种骨骼肌中GRP78蛋白表达水平均显著升高,POST组又不同程度地下降或恢复至冬眠前水平。与LT组相比,IBA组跖

关键词：冬眠骨骼肌内质网应激葡萄糖调节蛋白78 perk信号通路

基于内质网应激perk信号通路探讨芍药汤对UC大鼠的作用机制

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湖南中医药大学学报 2021年第11期41卷 1663-1668页

作者：罗敏杜英杰姜燕诗肖金银林仁敬李帅军湖南中医药大学第二附属医院肛肠科湖南长沙410005

目的通过检测内质网应激蛋白激酶R样内质网激酶(perk)信号通路相关基因及蛋白的表达,探讨芍药汤治疗溃疡性结肠炎(UC)的作用机制。方法100只SD大鼠建立胃肠湿热证模型后,随机抽取25只作为空白组,其余大鼠用三硝基苯磺酸法在其基础上建... 详细信息

目的通过检测内质网应激蛋白激酶R样内质网激酶(perk)信号通路相关基因及蛋白的表达,探讨芍药汤治疗溃疡性结肠炎(UC)的作用机制。方法100只SD大鼠建立胃肠湿热证模型后,随机抽取25只作为空白组,其余大鼠用三硝基苯磺酸法在其基础上建立UC大鼠模型后分为模型组、柳氮磺吡啶组、芍药汤组,每组25只。空白组、模型组利用生理盐水灌胃,柳氮磺吡啶组利用柳氮磺吡啶灌胃,芍药汤组利用芍药汤灌胃。在灌胃第7、14天,各组大鼠分别进行大鼠疾病活动指数(DAI)评分;同时各组随机处死数量相同的大鼠进行大鼠的结肠黏膜损伤指数(CMDI)评分;用Western blot法及RT-PCR法检测结肠组织perk蛋白和mRNA的表达。结果造模4 d后,各模型大鼠结肠组织可见溃疡面,并经病检证实,提示造模成功。与空白组比较,各组各时间点DAI评分、CMDI评分均增高(Pperk蛋白和mRNA的表达:灌胃7 d时,与空白组相比,模型组及柳氮磺吡啶组p-perk蛋白和mRNA表达均升高(Pperk蛋白和mRNA表达较模型组低(Pperk蛋白和mRNA表达均升高(Pperk蛋白和mRNA表达较模型组及柳氮磺吡啶组低(Pperk信号通路的激活,从而改善UC大鼠的症状及体征,这可能是其治疗UC的作用机制。

关键词：芍药汤溃疡性结肠炎胃肠湿热型内质网应激 perk信号通路 DAI评分 CMDI评分

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