冬眠不同时期达乌尔黄鼠骨路肌中内盾网应激介导的PERK信号通路的作用研究

作     者：张洁 

作者单位：西北大学 

学位级别：硕士

导师姓名：高云芳

授予年度：2018年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 071003[理学-生理学] 

主      题：冬眠 骨骼肌 内质网应激 葡萄糖调节蛋白78 PERK信号通路 

摘      要：研究背景及目的:非冬眠动物(大鼠、小鼠、人类等)在机械去负荷、禁食、去神经、缺血再灌注等应激状态下,骨骼肌形态、功能均会受到损伤,出现骨骼肌萎缩。而冬眠动物,如达乌尔黄鼠(Spermophilus dauricus),在冬眠过程中,同处于去神经、禁食、后肢去负荷/不活动状态,且“冬眠-阵间觉醒循环中伴随着“缺血再灌注的应激挑战,其骨骼肌却未出现明显萎缩,对冬眠期间的恶劣环境展现出了极强的适应能力。因此,探究冬眠动物冬眠期间独特的骨骼肌适应和质量维持机制,是目前动物生理学领域一大难题。已有证据表明,内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ER stress)诱发的细胞自我调控机制-未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)在骨骼肌对外界刺激的响应过程中发挥着重要的调控作用。ER stress是机体处于不良环境时,内质网稳态失衡引起的一种应激反应。当ER stress产生时,内质网中未折叠蛋白数目剧增,这时葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78,GRP78)会从内质网跨膜蛋白,如蛋白激酶样内质网激酶(protein kinase-like ER kinase,PERK)、活化转录因子6(activating transcription factor 6,ATF6)、肌醇需酶1(inositol-requiring enzyme1,IRE1)上迅速解离下来,参与内质网腔中未折叠蛋白的正确折叠;与此同时,UPR三条信号通路启动,通过调控促生存或促凋亡相关基因的表达,促进细胞生存或死亡。因此,为了探究ER stress介导的UPR是否参与了冬眠动物冬眠期间骨骼肌的适应及维持机制,本研究以达乌尔黄鼠为实验对象,对冬眠不同时期后肢不同类型不同部位的骨骼肌中ER stress的产生与否及其介导的UPR中PERK信号通路相关指标的变化情况进行了检测。研究方法:使用红外热成像仪对黄鼠体温进行监测,观察并统计不同性别、体重对黄鼠冬眠阵睡眠时长的影响;以夏季活跃组(summer active group,SA)、冬眠前组(pre-hibernation group,PRE)、浅冬眠组(early torpor group,ET)、深冬眠组(late torpor group,LT)、阵间觉醒组(interbout arousal group,IBA)及出眠组(post-hibernation group,POST)六组黄鼠的跖肌(plantaris longus,PL)、腓肠肌(gastrocnemius,GAS)及半腱肌(semitendinosus,ST)为实验对象,采用冰冻切片、免疫荧光组织化学技术对肌纤维分型比例、肌纤维横截面积(muscle fiber cross section area,CSA)进行测定;Western blot技术对ER stress靶标分子GRP78,PERK信号通路相关蛋白(p-PERK,p-eIF2α,ATF4)的蛋白表达进行检测;实时荧光定量PCR技术,对grp78及atf4的mRNA相对表达量进行测定;TUNEL染色法对细胞凋亡进行了检测。研究结果:1.性别与体重对达乌尔黄鼠冬眠阵睡眠时长的影响不同性别之间和不同体重范围之间,达乌尔黄鼠冬眠阵睡眠时长无明显差异,均维持在7天左右。2.不同时期达乌尔黄鼠骨骼肌形态指标的变化(1)与SA和PRE组相比,黄鼠体重在冬眠阵(ET,LT,IBA)及POST组均出现显著降低。骨骼肌肌肉湿重(muscle wet weight,MWW)、肌重体重比(muscle wet weight/body weight,MWW/BW)的统计结果显示,与SA组相比,POST组PL,GAS和ST的MWW分别下降了11%,13%(P0.05)和20%(P0.001);但与PRE组相比,POST组PL,GAS和ST的MWW/BW分别升高了28%(P0.001),28%(P0.01)和16%(P0.01)。(2)与SA和PRE组相比,冬眠中三种骨骼肌的慢型肌纤维比例略有升高,POST组又基本恢复至冬眠前水平。与SA相比,POST组PL的慢型和快型CSA分别减小了12%和13%(P0.05);GAS的慢型和快型CSA分别下降了13%和13%(P0.05);ST的慢型和快型CSA分别下降了12%(P0.05)和17%(P0.01)。3.不同时期达乌尔黄鼠骨骼肌中ER stress靶标分子GRP78的蛋白与mRNA表达变化(1)蛋白水平:与SA和PRE组相比,LT组三种骨骼肌中GRP78蛋白表达水平均显著升高,POST组又不同程度地下降或恢复至冬眠前水平。与LT组相比,IBA组跖