热应激通过内质网应激介导PERK信号通路调控奶牛乳腺上皮细胞凋亡的机制研究

作     者：胡海涛 

作者单位：安徽农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：程建波

授予年度：2022年

学科分类：090603[农学-临床兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：奶牛乳腺上皮细胞 热应激 内质网应激 PERK信号通路 细胞凋亡 

摘      要：热应激是一直以来制约我国奶业发展的一个重要问题,热应激对奶牛造成多种危害,严重影响奶牛生产性能。内质网应激是机体遭遇环境刺激时的一种保护性反应,已有研究证实,热应激会导致奶牛乳腺上皮细胞发生热休克反应,并且引发细胞凋亡,但是导致奶牛乳腺上皮细胞凋亡的机制是否与热应激条件下奶牛乳腺上皮细胞中的内质网应激有关亟需进一步研究。本试验的目的在于通过建立奶牛乳腺上皮细胞热应激模型,探究热应激条件下内质网应激调控奶牛乳腺上皮细胞发生凋亡的机制。首先将混合生长的奶牛成纤维细胞和奶牛乳腺上皮细胞分离培养,得到纯化的奶牛乳腺上皮细胞后利用免疫荧光法进行奶牛乳腺上皮细胞鉴定,并建立奶牛乳腺上皮细胞热应激模型,以热休克反应和内质网应激相关的标志基因和细胞钙离子含量作为判断细胞发生热休克反应和内质网应激的判定指标。随后用内质网应激抑制剂4-PBA处理热应激奶牛乳腺上皮细胞,利用q RT-PCR和流式细胞仪检测内质网应激抑制剂4-PBA对热应激奶牛乳腺上皮细胞凋亡的缓解作用。采用内质网应激诱导剂Brefeldin A建立奶牛乳腺上皮细胞内质网应激模型,探究当抑制内质网应激条件下未折叠蛋白反应(UPR)中的PERK信号通路之后对奶牛乳腺上皮细胞凋亡相关基因的表达量、细胞活力及细胞凋亡率的影响。结果显示,本试验成功获得纯化的奶牛乳腺上皮细胞。通过建立奶牛乳腺上皮细胞热应激模型发现,41℃热处理2 h和3 h会诱导奶牛乳腺上皮细胞发生内质网应激,内质网应激相关的标记基因GRP78、PERK、XBP1 m RNA的表达量较37℃正常培养条件下显著升高(P0.05),并且细胞中钙离子含量也显著升高(P0.05),且与细胞凋亡相关的Caspase 3和Caspase 8 m RNA表达量极显著升高(P0.01),Bcl2 m RNA表达量极显著降低(P0.01),细胞抗凋亡能力降低。4 mmol 4-PBA可降低热应激时奶牛乳腺上皮细胞中内质网应激标记基因的表达量,并且Bax、Caspase 3和Caspase 8 m RNA表达量较41℃热处理对照组显著降低(P0.05),细胞凋亡率也显著降低(P0.05)。Brefeldin A处理奶牛乳腺上皮细胞3 h建立内质网应激模型,内质网应激相关的标记基因GRP78、PERK和e IF2αm RNA的表达量较空白对照组显著升高(P0.05),且细胞增殖被抑制。抑制奶牛乳腺上皮细胞内质网应激条件下UPR中PERK信号通路后,与Brefeldin A处理组相比,细胞中PERK、ATF4和CHOP m RNA表达量显著降低(P0.05),同时,Bax和Caspase 3 m RNA表达量也显著降低(P0.05),细胞凋亡率显著降低(P0.05)。综上所述,本试验成功获得了纯化的奶牛乳腺上皮细胞。奶牛乳腺上皮细胞在41℃高温培养条件下会发生热休克反应,并诱导细胞内质网应激,同时,细胞凋亡增加;4 mmol 4-PBA可通过抑制内质网应激缓解热应激诱导的奶牛乳腺上皮细胞凋亡;抑制内质网应激条件下奶牛乳腺上皮细胞中的PERK信号通路可缓解内质网应激导致的细胞凋亡,为热应激导致的奶牛乳腺上皮细胞凋亡的机制研究提供了新的理论依据。