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基于Nrf2-ARE信号通路对T-2毒素诱导DF-1细胞氧化应激调控机制的研究

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基于Nrf2-ARE信号通路对T-2毒素诱导DF-1细胞氧化应激调控机制的...

作者：熊款款湖南农业大学

学位级别：硕士

T-2毒素(T2)在A类单端孢霉烯族毒素中毒性最强,且分布广泛,如进入饲料生产、运输、加工等生产链中,将会对动物的健康造成极大危害,进而威胁畜牧业的健康发展。研究表明T2可诱导细胞发生氧化应激,进而调控细胞损伤。Nrf2-ARE信号通路是... 详细信息

T-2毒素(T2)在A类单端孢霉烯族毒素中毒性最强,且分布广泛,如进入饲料生产、运输、加工等生产链中,将会对动物的健康造成极大危害,进而威胁畜牧业的健康发展。研究表明T2可诱导细胞发生氧化应激,进而调控细胞损伤。Nrf2-ARE信号通路是细胞抗氧化调控的重要机制,核因子E2相关因子2(nrf2)是细胞抗氧化的关键因子。nrf2是否调控T2所致氧化应激尚无相关报道。基于此本研究旨在探索肉鸡源nrf2蛋白对T2所致氧化损伤的调控机制。主要研究内容如下:1.研究T2对鸡成纤维细胞(DF-1)细胞的毒性作用及其氧化应激反应。首先用不同浓度T2处理DF-1细胞,检测细胞活性和乳酸脱氢酶(LDH)漏出率,观察细胞状态,评估毒素对细胞的毒性作用;然后再检测细胞内的活性氧(ROS)水平、丙二醛(MDA)含量及总谷胱甘肽(GSH)含量、总谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)活性,评估毒素对细胞的氧化应激水平的影响;最后检测Nrf2-ARE信号通路相关基因,包括nrf2、Keap1、Gpx-1、Nqo1及Hmox1的mRNA的表达水平,分析T2对该信号通路的影响。结果发现,随着T2浓度升高,DF-1细胞活性下降(Pnrf2 mRNA表达均显著升高(P2可导致DF-1细胞发生毒性作用并诱导氧化应激,且nrf2-AER信号通路参与上述过程。2.构建稳定的nrf2过表达及干扰的DF-1细胞系。通过慢病毒转导系统及sh RNA干扰技术构建稳定过表达和敲降nrf2表达的DF-1细胞系,用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)及蛋白免疫印迹(Western-blot)技术检验nrf2 mRNA和蛋白的过表达及敲降效率,并用MTT法检测所构建细胞系的细胞活性。结果显示,在nrf2过表达—DF-1细胞系中,nrf2 mRNA与蛋白水平均显著上调(Pnrf2干扰—DF-1细胞系中,nrf2 mRNA与蛋白水平均显著下调(P2个细胞系与正常DF-1细胞系比较,细胞活性无显著差异(P>0.05)。3.验证Nrf2-ARE信号通路是调控DF-1细胞抗氧化应激的重要途径。用50 n M的T2与正常DF-1细胞、nrf2过表达及干扰的DF-1细胞分别共孵育24 h,检测氧化应激相关指标及Nrf2-ARE信号通路下游抗氧化因子mRNA与蛋白水平表达。结果显示,上调nrf2蛋白导致DF-1细胞氧化应激水平下降(PNrf2-ARE信号通路下游抗氧化因子mRNA与蛋白水平的表达(Pnrf2蛋白,可导致DF-1细胞氧化应激水平升高(PNrf2-ARE信号通路下游抗氧化因子mRNA与蛋白水平的表达(PNrf2-ARE信号通路介导T2致DF-1细胞氧化应激进程,且nrf2蛋白是调控该过程的关键蛋白。综上,本研究揭示了T2对DF-1细胞的毒性作用及其氧化应激反应,同时利用慢病毒转导系统及sh RNA干扰技术构建稳定过表达与干扰nrf2的DF-1细胞系,最后验证了nrf2蛋白是调控T2致DF-1细胞氧化应激进程的关键蛋白,为研究该毒素对于肉鸡的危害作用提供理论依据,同时也为nrf2蛋白在肉鸡的生产养殖中的运用提供研究基础,为后续治疗畜禽氧化应激相关的疾病提供新的思路。

关键词： T-2毒素氧化应激 Nrf2-ARE信号通路慢病毒

菟丝子黄酮通过ERK/Nrf2-ARE信号通路缓解睾丸氧化损伤的研究

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菟丝子黄酮通过ERK/Nrf2-ARE信号通路缓解睾丸氧化损伤的研究

作者：李利娟新疆医科大学

学位级别：硕士

目的:探究菟丝子黄酮（Total Flavonoids from Semen Cuscutae,TFSC）缓解睾丸氧化损伤的作用及其可能机制。方法:1)将48只雄性Balb/c小鼠随机分为四组:对照组、模型组、TFSC低剂量组和TFSC高剂量组,每组12只。除对照组,其余各组均用腹... 详细信息

目的:探究菟丝子黄酮（Total Flavonoids from Semen Cuscutae,TFSC）缓解睾丸氧化损伤的作用及其可能机制。方法:1)将48只雄性Balb/c小鼠随机分为四组:对照组、模型组、TFSC低剂量组和TFSC高剂量组,每组12只。除对照组,其余各组均用腹腔注射环磷酰胺（cyclophosphamide,CP）构建睾丸损伤模型,TFSC低（35mg/kg）、高（70mg/kg）剂量组分别进行TFSC灌胃干预,连续4周。观察小鼠体重、生殖器官指数和精子数目及活率;组织切片观察睾丸形态改变;FRAP法和TBA法检测睾丸组织中T-AOC和MDA含量变化;2)ELISA检测小鼠血清睾酮含量;3)Western blotting检测睾丸组织中p-ERK/ERK、nrf2、NQO1、HO-1、Bax和Bcl-2蛋白的表达情况;4)体外培养TM3细胞（小鼠睾丸间质细胞）,CCK8法筛选丙烯醛（acrolein,ACR）的细胞半数致死量及TFSC的最适作用剂量;设置对照组、ACR模型组、TFSC低（100μg/m L）、中（200μg/m L）、高（400μg/m L）剂量组;CCK8检测TFSC对ACR诱导的细胞增殖的影响;5)流式细胞仪检测TM3细胞的凋亡情况;6)FRAP法和TBA法检测TM3细胞中T-AOC和MDA含量变化;7)Western blotting检测细胞中p-ERK/ERK、nrf2、NQO1、HO-1、Bax、caspase-3和Bcl-2蛋白的表达情况。结果:1)与对照组相比,模型组小鼠体重、睾丸重量及睾丸指数、精子数目及活率均明显降低（P＜0.05）,睾丸组织结构受损,生精小管内的各级生精细胞层数减少,排列紊乱,管腔变大,腔内精子细胞数量稀疏;睾丸组织内氧化应激指标MDA明显升高（P＜0.05）,总抗氧化能力（T-AOC）降低（P＜0.05）,提示造模成功。与模型组相比,TFSC干预组小鼠体重、睾丸重量及睾丸指数、精子数目及精子活率均升高（P＜0.05）,睾丸组织损伤程度减弱,T-AOC升高（P＜0.05）,MDA含量降低（P＜0.05）,睾丸氧化损伤缓解;2)ELISA结果显示,与对照组相比,模型组睾酮含量降低（P＜0.05）;与模型组相比,TFSC高剂量组小鼠血清睾酮含量升高（P＜0.05）;3)Western blotting结果显示,与对照组相比,模型组睾丸组织中p-ERK/ERK、nrf2、NQO1、HO-1和Bcl-2蛋白表达降低（P＜0.05）,Bax蛋白表达升高（P＜0.05）;与模型组相比,TFSC干预组睾丸组织p-ERK/ERK、nrf2、NQO1和Bcl-2蛋白表达升高（P＜0.05）,Bax蛋白表达降低（P＜0.05）;4)TFSC浓度为100、200和400μg/m L时明显促进TM3细胞增殖（P＜0.05）;ACR浓度为33.97μmol/L时,达到细胞半数致死量。与对照组相比,模型组细胞增殖率明显降低（P＜0.05）;与模型组相比,TFSC中、高剂量组细胞增殖率升高（P＜0.05）;5)流式结果显示,与对照组相比,ACR干预TM3细胞后,凋亡率明显增高（P＜0.05）;而TFSC中、高剂量组细胞凋亡率降低（P＜0.05）;6)与对照组相比,ACR模型组MDA含量升高（P＜0.05）,T-AOC降低（P＜0.05）;与ACR模型组相比,TFSC干预后细胞内MDA含量降低（P＜0.05）,T-AOC升高（P＜0.05）;7)Western blotting结果显示,p-ERK/ERK、nrf2、NQO1、HO-1和Bcl-2蛋白表达在ACR模型组明显降低（P＜0.05）,而TFSC能提高其表达（P＜0.05）;Bax和caspase-3蛋白表达在ACR模型组明显升高（P＜0.05）,TFSC能降低其表达（P＜0.05）。加入nrf2抑制剂ML385后,与抑制剂未干预组相比,nrf2、NQO1、HO-1和Bcl-2的表达降低（P＜0.05）,Bax的表达升高（P＜0.05）。结论:TFSC可能通过激活ERK/Nrf2-ARE信号通路,促进TM3细胞增殖,抑制其凋亡,从而缓解环磷酰胺诱导的小鼠睾丸氧化损伤。

关键词：菟丝子黄酮睾丸 TM3细胞睾酮 Nrf2-ARE信号通路

探讨Nrf2-ARE信号通路在宫颈癌耐药中的作用及相关机理

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中文科技期刊数据库（全文版）医药卫生 2023年第7期 0048-0051页

作者：李婉欣陈一帆娜吉曼·地力夏提夏宇卢霞新疆医科大学新疆乌鲁木齐830017 新疆医科大学第六附属医院妇产科新疆乌鲁木齐830000

探讨Nrf2-ARE信号通路在宫颈癌耐药中的作用及机制。方法选取宫颈癌细胞SiHa与顺铂耐药细胞SiHa/cDDP进行细胞培养与处理,采用Western blot、Real-time PCR法检测SiHa、SiHa/cDDP中Nrf2-ARE信号通路及相关靶基因的表达情况,进而分析nrf... 详细信息

探讨Nrf2-ARE信号通路在宫颈癌耐药中的作用及机制。方法选取宫颈癌细胞SiHa与顺铂耐药细胞SiHa/cDDP进行细胞培养与处理,采用Western blot、Real-time PCR法检测SiHa、SiHa/cDDP中Nrf2-ARE信号通路及相关靶基因的表达情况,进而分析nrf2下游基因与宫颈癌患者铂类耐药发生的关系及机制。结果 MTT检测结果显示SiHa/cDDP与SiHa对顺铂IC50为(8.59±0.73)mg/L与(0.62±0.13)mg/L ,SiHa/cDDP细胞Keap1、nrf2以及相关靶基因NQO1、GSTP1、GCL的mRNA表达水平明显高于SiHa细胞,差异有统计学意义(PNrf2-ARE信号通路在宫颈癌顺铂耐药现象的产生中具有发挥重要的影响作用,基于Nrf2-ARE信号通路开发的耐药拮抗剂可在宫颈癌耐药的辅助治疗中有着一定的临床意义与重要作用。

关键词： Nrf2-ARE信号通路宫颈癌顺铂耐药辅助治疗临床疗效

Nrf2-ARE信号通路参与肝脏疾病病理机制研究进展

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中国药理学通报 2015年第8期31卷 1057-1061页

作者：曹玲娟龚慧颜苗李焕德孙莉中南大学湘雅二医院药学部中南大学临床药学研究所湖南长沙410011 中南大学药学院湖南长沙410013

核因子NF-E2相关因子2(nrf2)是细胞抵御氧化应激的一个重要转录因子,它能够在活性氧或亲电试剂的刺激下,转位进入细胞核,并与抗氧化反应元件(ARE)相互作用,从而诱导下游保护性Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶的表达,达到细胞保护的作用。氧化应激... 详细信息

核因子NF-E2相关因子2(nrf2)是细胞抵御氧化应激的一个重要转录因子,它能够在活性氧或亲电试剂的刺激下,转位进入细胞核,并与抗氧化反应元件(ARE)相互作用,从而诱导下游保护性Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶的表达,达到细胞保护的作用。氧化应激是诸多肝脏疾病共同的发病机制,而nrf2-ARE是体内一条极为重要的抗氧化应激信号通路,该通路在肝脏疾病的发生、发展及预防过程中起着非常重要的作用,nrf2或将成为肝脏疾病治疗的新靶点。该文综述了Nrf2-ARE信号通路参与肝脏疾病病理机制的最新研究进展,以期为日后相关研究提供参考。

关键词： Nrf2-ARE信号通路药物性肝损伤胆汁淤积性肝病非酒精性脂肪性肝病酒精性脂肪肝肝纤维化肝癌

基于Nrf2-ARE信号通路探讨加味丹参饮对心肌缺血再灌注损伤的影响及其作用机制

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吉林医学 2022年第3期43卷 584-586页

作者：张姚谭琦戴垠坤湖南中医药大学第一附属医院心血管内科湖南长沙410000

目的:基于Nrf2-ARE信号通路探讨加味丹参饮对心肌缺血再灌注损伤的影响及其作用机制。方法:纳入30只家兔,分为空白组、干预组[加味丹参饮+莱菔硫烷(nrf2激活剂)]和单纯心肌缺血再灌注组(模型组),每组各有10只家兔,对比三组家兔的nrf2-AR... 详细信息

目的:基于Nrf2-ARE信号通路探讨加味丹参饮对心肌缺血再灌注损伤的影响及其作用机制。方法:纳入30只家兔,分为空白组、干预组[加味丹参饮+莱菔硫烷(nrf2激活剂)]和单纯心肌缺血再灌注组(模型组),每组各有10只家兔,对比三组家兔的Nrf2-ARE信号通路指标,凋亡细胞数量。结果:干预组家兔的Nrf2-ARE信号通路指标高于另外两组,凋亡细胞数量明显低于模型组。以上指标差异显著,有统计学意义(P<0.05)。干预组和模型组都出现了心肌纤维着色不均匀、排列混乱情况,但是干预组心肌细胞坏死范围更小,炎性细胞浸润情况更轻。结论:针对心肌缺血再灌注损伤采用加味丹参饮进行干预,可以帮助更好地保护研究对象的心肌细胞,有更优的改善效果。

关键词：心肌缺血再灌注损伤 Nrf2-ARE信号通路加味丹参饮

Nrf2-ARE信号通路影响糖尿病心肌梗死氧化应激的机制研究

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吉林医学 2023年第11期44卷 3021-3024页

作者：刘平方蔡承哲冯小倩叶贤区许卓帆广州市第十二人民医院广东广州510620

目的:对糖尿病心肌梗死大鼠氧化应激进行研究,探讨Nrf2-ARE信号通路在其中的作用机制。方法:取清洁级别SD雄性大鼠共60只,对40只行2型糖尿病模型制备,取20只进入糖尿病组(DM组),20只进行前降支结扎制备成糖尿病合并心肌梗死模型进入糖... 详细信息

目的:对糖尿病心肌梗死大鼠氧化应激进行研究,探讨Nrf2-ARE信号通路在其中的作用机制。方法:取清洁级别SD雄性大鼠共60只,对40只行2型糖尿病模型制备,取20只进入糖尿病组(DM组),20只进行前降支结扎制备成糖尿病合并心肌梗死模型进入糖尿病合并心肌梗死组(DMI组),余20只健康大鼠作为空白组。喂养1 w后,对三组大鼠的心肌组织活性氧(ROS)、活性氮(RON)及过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、血红素氧化酶1(HO-1)、核因子E2相关因子2(nrf2)表达情况进行比较,对Nrf2-ARE信号通路与糖尿病心肌梗死大鼠氧化应激的相关性应用Pearson法进行分析。结果:DM组和DMI组大鼠心肌组织HO-1、nrf表达水平与空白组相比较呈逐渐降低,且DMI组降低更为显著(F=28.432、20.501,均P25.922、41.336、75.895、27.423,均Pnrf表达水平均呈负相关(r=-0.457、-0.658、-0.752、-0.512,均PNrf2-ARE信号通路可能通过CAT、SOD分子影响、调控其氧化应激反应,从而使细胞及组织避免受损,极具临床应用价值。

关键词： Nrf2-ARE信号通路糖尿病心肌梗死大鼠氧化应激作用机制

褪黑素对大鼠急性脊髓损伤后Nrf2-ARE信号通路的影响

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中华物理医学与康复杂志 2017年第6期39卷 406-411页

作者：苗金红理阳汪鑫朱海洋钟斌李鹏辉苏一帆徐玉生郑州大学第一附属医院郑州450000

目的观察褪黑素（MT）对大鼠急性脊髓损伤后血红素氧化酶-1（HO-1）、磷酸酰胺腺嘌呤二核苷酸醌氧化还原酶-1（NQO-1）、红细胞衍生的核因子2相关因子2（nrf2）表达的影响，探讨褪黑素在Nrf2-ARE信号通路中的作用机制。方法采用随机... 详细信息

目的观察褪黑素（MT）对大鼠急性脊髓损伤后血红素氧化酶-1（HO-1）、磷酸酰胺腺嘌呤二核苷酸醌氧化还原酶-1（NQO-1）、红细胞衍生的核因子2相关因子2（nrf2）表达的影响，探讨褪黑素在Nrf2-ARE信号通路中的作用机制。方法采用随机数字表法将72只成年SD大鼠分为对照组、损伤组及褪黑素组，每组24只。采用改良Allen＇s法将损伤组及褪黑素组大鼠制成T11-T12脊髓损伤模型，并分别在脊髓损伤10min后腹腔注射等量无水乙醇或MT制剂；对照组仅行椎板切除暴露T11-T12节段，不损伤脊髓神经。各组分别于制模后6h、12h、24h时随机选取6只大鼠处死，提取T11-T12节段脊髓标本。采用HE染色法观察脊髓损伤及炎性反应情况；采用免疫荧光法检测HO-1、NQO-1及nrf2蛋白表达；采用RT-PCR法检测大鼠脊髓组织中HO-1、NQO-1、nrf2 mRNA表达。结果对照组脊髓神经元细胞形态正常，无水肿及坏死，无明显出血点；损伤组脊髓可见出血灶，炎性细胞明显增多，部分神经元水肿、坏死；褪黑素组脊髓出血灶较损伤组明显减小，神经元水肿程度亦相对较轻。在制模后12h、24h时发现褪黑素组脊髓HO-1、NQO-1及nrf2 mRNA表达水平均显著强于损伤组及对照组（均P〈0.05），损伤组脊髓HO-1、NQO-1及nrf2 mRNA表达水平亦显著强于对照组（均P〈0.05）。免疫荧光结果显示：褪黑素组脊髓切片中HO-1、NQO-1、nrf2阳性细胞数量最多，损伤组次之，对照组最少，各组间差异均具有统计学意义（均P〈0.05）。结论褪黑素可促进急性脊髓损伤大鼠脊髓中HO-1、NQO-1及nrf2表达，其作用机制可能与激活Nrf2-ARE信号通路有关。

关键词：脊髓损伤褪黑素 Nrf2-ARE信号通路

基于Nrf2-ARE信号通路探析己酮可可碱对癫痫大鼠脑内氧化应激的影响

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医学研究生学报 2020年第2期33卷 144-148页

作者：孙光涛戚询中邹春颖王克健黄作义佳木斯大学附属第一医院神经四科佳木斯154002

目的基于核因子E2相关因子2(nrf2)-抗氧化反应元件(ARE)信号通路探析己酮可可碱(PTX)对癫痫(EP)大鼠脑内氧化应激的影响。方法实验纳入36只健康、成年雄性Wistar大鼠,并按照完全随机法分为空白对照组(腹腔注射等渗盐水)、EP对照组(诱发E... 详细信息

目的基于核因子E2相关因子2(nrf2)-抗氧化反应元件(ARE)信号通路探析己酮可可碱(PTX)对癫痫(EP)大鼠脑内氧化应激的影响。方法实验纳入36只健康、成年雄性Wistar大鼠,并按照完全随机法分为空白对照组(腹腔注射等渗盐水)、EP对照组(诱发EP发作)、PTX组(诱发EP发作+PTX预处理),每组12只。观察各组大鼠行为学改变,记录EP发作率、发作潜伏期,断头处死取黑质、海马组织后检测氧化应激指标及Nrf2-ARE信号通路相关蛋白表达水平。结果给药后空白对照组大鼠未见异常反应,PTX组EP发作率(33.3%)、发作等级[(2.14±0.40)vs(3.09±0.58)]均明显低于EP对照组,且发作潜伏期明显延长(Pnrf2、HO-1蛋白表达明显降低(Pnrf2相比EP对照组,显著增加[(0.72±0.09)vs(0.30±0.04)、(0.34±0.06)vs(0.21±0.03)]、HO-1[(0.66±0.08)vs(0.34±0.05)、(0.48±0.08)vs(0.31±0.05)],NQO-1蛋白表达显著增加[(0.48±0.07)vs(0.25±0.06)、(0.78±0.11)vs(0.68±0.07),P0.05),黑质组织表达明显高于空白对照组水平(PNrf2-ARE信号通路。

关键词： Nrf2-ARE信号通路己酮可可碱癫痫氧化应激

Nrf2-ARE信号通路在调节慢性阻塞性肺疾病氧化失衡过程中的作用机制

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广东医学 2016年第12期37卷 1808-1810页

作者：田戈姜敏新疆医科大学附属中医医院国家中医临床研究基地新疆呼吸病研究重点实验室乌鲁木齐830000

目的研究Nrf2-ARE信号通路上关键因子的表达变化情况,探讨Nrf2-ARE信号通路在调节慢性阻塞性肺疾病氧化失衡过程中的作用机制。方法将80只小鼠随机分成4组,对照组不熏烟,在相同环境下饲养6个月,其余3组分别为熏烟2个月组、熏烟4个月组... 详细信息

目的研究Nrf2-ARE信号通路上关键因子的表达变化情况,探讨Nrf2-ARE信号通路在调节慢性阻塞性肺疾病氧化失衡过程中的作用机制。方法将80只小鼠随机分成4组,对照组不熏烟,在相同环境下饲养6个月,其余3组分别为熏烟2个月组、熏烟4个月组和熏烟6个月组,造模结束后取材。应用Fenton反应检测肺组织匀浆中抑制羟自由基能力,ELISA法检测血清中nrf2和谷胱甘肽(GSH)的表达,利用Real-Time PCR方法检测肺组织中nrf2、半胱氨酸合成酶(γ-GCS)mRNA的表达,并对结果行相关分析。结果 Fenton反应结果显示抑制羟自由基能力在熏烟6个月组显著高于对照组(P0.05),熏烟6个月组γ-GCS mRNA水平显著高于对照组(Pnrf2蛋白及mRNA在各组的表达无明显差异(P>0.05)。结论过氧化物在熏烟各组小鼠肺组织中累积,可能通过活化nrf2、促进nrf2核积聚上调γ-GCS的基因表达,在氧化失衡中发挥作用。

关键词：慢性阻塞性肺病氧化应激 Nrf2-ARE信号通路 γ-谷氨酰半胱氨酸合酶