基于Nrf2-ARE信号通路对T-2毒素诱导DF-1细胞氧化应激调控机制的研究

作     者：熊款款 

作者单位：湖南农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：杨凌宸

授予年度：2022年

学科分类：090603[农学-临床兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：T-2毒素 氧化应激 Nrf2-ARE信号通路 慢病毒 

摘      要：T-2毒素(T2)在A类单端孢霉烯族毒素中毒性最强,且分布广泛,如进入饲料生产、运输、加工等生产链中,将会对动物的健康造成极大危害,进而威胁畜牧业的健康发展。研究表明T2可诱导细胞发生氧化应激,进而调控细胞损伤。Nrf2-ARE信号通路是细胞抗氧化调控的重要机制,核因子E2相关因子2(Nrf2)是细胞抗氧化的关键因子。Nrf2是否调控T2所致氧化应激尚无相关报道。基于此本研究旨在探索肉鸡源Nrf2蛋白对T2所致氧化损伤的调控机制。主要研究内容如下:1.研究T2对鸡成纤维细胞(DF-1)细胞的毒性作用及其氧化应激反应。首先用不同浓度T2处理DF-1细胞,检测细胞活性和乳酸脱氢酶(LDH)漏出率,观察细胞状态,评估毒素对细胞的毒性作用;然后再检测细胞内的活性氧(ROS)水平、丙二醛(MDA)含量及总谷胱甘肽(GSH)含量、总谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)活性,评估毒素对细胞的氧化应激水平的影响;最后检测Nrf2-ARE信号通路相关基因,包括Nrf2、Keap1、Gpx-1、Nqo1及Hmox1的mRNA的表达水平,分析T2对该信号通路的影响。结果发现,随着T2浓度升高,DF-1细胞活性下降(P0.05)。3.验证Nrf2-ARE信号通路是调控DF-1细胞抗氧化应激的重要途径。用50 n M的T2与正常DF-1细胞、Nrf2过表达及干扰的DF-1细胞分别共孵育24 h,检测氧化应激相关指标及Nrf2-ARE信号通路下游抗氧化因子mRNA与蛋白水平表达。结果显示,上调Nrf2蛋白导致DF-1细胞氧化应激水平下降(P0.05),且上调Nrf2-ARE信号通路下游抗氧化因子mRNA与蛋白水平的表达(P0.05);而下调Nrf2蛋白,可导致DF-1细胞氧化应激水平升高(P0.05),且下调Nrf2-ARE信号通路下游抗氧化因子mRNA与蛋白水平的表达(P0.05)。上述结果说明Nrf2-ARE信号通路介导T2致DF-1细胞氧化应激进程,且Nrf2蛋白是调控该过程的关键蛋白。综上,本研究揭示了T2对DF-1细胞的毒性作用及其氧化应激反应,同时利用慢病毒转导系统及sh RNA干扰技术构建稳定过表达与干扰Nrf2的DF-1细胞系,最后验证了Nrf2蛋白是调控T2致DF-1细胞氧化应激进程的关键蛋白,为研究该毒素对于肉鸡的危害作用提供理论依据,同时也为Nrf2蛋白在肉鸡的生产养殖中的运用提供研究基础,为后续治疗畜禽氧化应激相关的疾病提供新的思路。