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aav载体质粒介导的荧光素酶shRNA抑制其在哺乳动物细胞中的表达

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中华实验和临床病毒学杂志 2002年第3期16卷 253-255页

作者：马鑫鲁晓春彭建强谭淑萍袁振华尹芳王宏吴小兵侯云德中国预防医学科学院病毒学研究所基因室北京100052 解放军总医院老年心内科本元正阳基因技术股份有限公司广州南方医院血液科

目的　构建荧光素酶短发夹环产生质粒在BHK 2 1细胞中抑制荧光素酶的表达。方法　从人基因组DNA中用PCR方法调出人U6snRNA启动子 ,接以被 9bp序列间隔的 2 1bp荧光素酶靶序列的反向重复序列 ,置于aav载体质粒pSNAV中 ,构建成荧光素酶短... 详细信息

目的　构建荧光素酶短发夹环产生质粒在BHK 2 1细胞中抑制荧光素酶的表达。方法　从人基因组DNA中用PCR方法调出人U6snRNA启动子 ,接以被 9bp序列间隔的 2 1bp荧光素酶靶序列的反向重复序列 ,置于aav载体质粒pSNAV中 ,构建成荧光素酶短发夹环RNA(shRNA)产生质粒pSNAV U6 Luc。与pMAMneoLuc质粒共转染BHK 2 1细胞 ,检测其对荧光素酶表达的影响。并且单独转染荧光素酶细胞株 ,检测其抑制荧光素酶表达的效果。结果　pSNAV U6 Luc对共转染的pMAMneoLuc中荧光素酶的表达抑制 5 0 % ,而对荧光素酶细胞株中荧光素酶的表达抑制 70 %。结论　实验表明荧光素酶shRNA产生质粒能够有效抑制荧光素酶在BHK 2 1细胞中的表达。

关键词： aav载体质粒介导荧光素酶短发夹环RNA 哺乳动物基因表达

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双链aav载体的构建及其转导效率的检测

南京医科大学学报（自然科学版） 2007年第11期27卷 1348-1348页

作者：吴剑卿赵卫红南京医科大学第一附属医院老年医学科江苏南京210029 南京医科大学第一附属医院肾科江苏南京210029

基因治疗为人类多种疾病的治疗带来了希望．但其临床应用的道路曲折．问题在于安全和有效的基因输送系统的开发。如何将治疗基因特异、有效地传递给靶细胞，这是基因治疗中的关键。腺相关病毒（aav）已被广泛用作基因治疗的载体。由于... 详细信息

基因治疗为人类多种疾病的治疗带来了希望．但其临床应用的道路曲折．问题在于安全和有效的基因输送系统的开发。如何将治疗基因特异、有效地传递给靶细胞，这是基因治疗中的关键。腺相关病毒（aav）已被广泛用作基因治疗的载体。由于其安全性和低免疫反应性而受到人们的青睐，目前尚未见aav与恶性疾病明确有关的报道。aav为单链DNA病毒，由单链基因组向有转录活性的双链形式的转变限制了aav载体介导的基因转导。自身互补双链DNA的腺相关病毒（scaav）载体绕开了病毒DNA第二条链合成这一限速步骤，能显著提高aav的转导效率。本研究率先在国内进行scaav的构建和包装．并检测其转导效率。

关键词： aav载体双链DNA 基因转导检测单链DNA病毒基因治疗腺相关病毒恶性疾病

aav-CRISPR/Cas9介导的血友病A基因治疗研究进展

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中国实验血液学杂志 2023年第6期31卷 1890-1893页

作者：房帅王刚杨林花山西医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室山西医科大学第二医院血液科山西太原030001

血友病A是一种由凝血因子Ⅷ突变引起的X-连锁隐性出血性疾病。目前主要以外源凝血因子替代治疗为主。随着基因治疗的不断发展,为血友病A的治疗提供了新的研究方向。应用CRISPR-Cas9技术选择合适的靶位点,并通过相应的载体介导外源性B结... 详细信息

血友病A是一种由凝血因子Ⅷ突变引起的X-连锁隐性出血性疾病。目前主要以外源凝血因子替代治疗为主。随着基因治疗的不断发展,为血友病A的治疗提供了新的研究方向。应用CRISPR-Cas9技术选择合适的靶位点,并通过相应的载体介导外源性B结构域删除的FⅧ变异体基因定向敲入和高效表达,达到治疗血友病A的目的。CRISPR-Cas9技术作为一种新兴的基因编辑工具,具有极大的高效性、安全性和有效性,已广泛用于血友病基因治疗研究。本文就现阶段血友病A基因治疗的载体选择、治疗基因的构建、基因编辑技术及表达靶位的选择进行综述。

关键词：血友病A CRISPR-Cas9 基因治疗 aav载体表达靶位

raav9介导的VEGF165基因治疗与左西孟旦药物治疗对AMI小鼠心肌保护作用的对比研究

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rAAV9介导的VEGF165基因治疗与左西孟旦药物治疗对AMI小鼠心肌保...

作者：付明明郑州大学

学位级别：硕士

研究背景及目的急性心肌梗死是一种由于长期缺血导致心肌细胞死亡的疾病,它是冠脉疾病最严重的表现。心肌梗死的修复与血管状况密切相关,血管的快速生成对于建立良好的侧支循环,改善梗死区的血液供应,最终影响心梗后的生存和预后,具有... 详细信息

研究背景及目的急性心肌梗死是一种由于长期缺血导致心肌细胞死亡的疾病,它是冠脉疾病最严重的表现。心肌梗死的修复与血管状况密切相关,血管的快速生成对于建立良好的侧支循环,改善梗死区的血液供应,最终影响心梗后的生存和预后,具有非常重要的意义。将血管再生基因转移至局部缺血心肌有望成为治疗缺血性心脏病(Ischemic heart disease,IHD)的有效方法,与经皮冠脉介入和冠状动脉搭桥手术等临床应用相比,高效基因传递系统与心肌特异性启动子的组合应用可能提供足够的生物安全性。已经表明,血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)是血管生成过程中的关键调节因子,VEGF165能够以剂量依赖方式增强心室肌细胞L型钙电流。腺相关病毒(Adeno-associated virus,aav)载体可以将VEGF基因有效地递送到缺血性小鼠心肌中。然而,在心肌内注射后,可在心外器官发现aav基因组,并且开胸注射的二次伤害对体质虚弱的IHD患者来说是沉重的打击。为确保以最小侵入手段准确地向心肌内递送目的基因,我们使用了心肌特异性肌钙蛋白T(cTNT)启动子和促进基因表达的内含子和转录后调控因子WPRE来调控心脏特异性的hVEGF165表达。构建了raav-cTNT-VEGF 165-Flag-EGFP-WPRE载体系统,通过尾静脉注射载体感染心梗小鼠心脏。左西孟旦,钙离子增敏剂,是一种新颖的正性肌力药,一方面通过直接与肌钙蛋白C结合改变心肌纤维的钙结合信息的传递使心肌收缩力增加,而不影响心率和心室舒张功能。另一方面通过激活平滑肌细胞膜ATP敏感的钾通道使血管扩张,降低心脏前后负荷和冠脉循环阻力,对治疗心衰有利。当大剂量使用时,具有一定的磷酸二酯酶抑制作用,起到额外的正性肌力作用。本研究建立在小鼠急性心肌梗死模型的基础上,分别采用raav-cTNT-VEGF165载体基因治疗和左西孟旦间断重复给药抗心衰治疗,初步探讨两种治疗方法对心肌梗死小鼠的心肌保护作用及其机制,对比两种方法治疗效果的差异性和优越性;探讨尾静脉递送raav介导的人源VEGF165基因的可行性,为以VEGF165为基础的基因治疗心肌梗死提供临床应用基础。研究方法采用冠状动脉左前降支结扎术制作小鼠急性心肌梗死模型,随机分为假手术组(sham,n=15),生理盐水组(NS,100μl,n=25),aav-EGFP 处理组(EGFP,5×1011V.G./100μl,n=25),aav-VEGF165 治疗组(VEGF,5×1011V.G./100μl,n=25)和左西孟旦治疗组(levo.,1365μg/kg·1w,n=25)。1.分别于术前、术后2W、术后4W采用心脏超声法检测小鼠心功能,计算左室射血分数(LVEF%)、左室短轴缩短率(LVFS%)、左室收缩末内径(LVIDs)、左室舒张末内径(LVIDd)、收缩末左室后壁厚度(LVPWs)、舒张末左室后壁厚度(LVPWd)、舒张末左室前壁厚度(LVAWd)、收缩末左室前壁厚度(LVAWs)。2.通过心肌组织冰冻切片共聚焦显微镜观察用绿色荧光蛋白(EGFP)标记的hVEGFA的表达水平及表达部位;免疫组织化学染色法检测VEGFA,CD31,PCNA表达水平及表达部位,TUNEL法检测心肌组织细胞凋亡水平。3.应用实时荧光定量PCR技术(RT-qPCR)测定小鼠心肌组织VEGF165,VEGFR2,Collagen Ⅲ mRNA含量和蛋白质印迹术(Western blot,WB)检测心肌组织VEGFA,Bax,Bcl-2蛋白的相对表达。4.组织学评估HE染色法检测梗死周边区心肌细胞大小形态等病理变化,Masson染色观察心肌间质胶原沉积和计算心肌梗死面积。通过测量心重/体重(HW/BW)、肺重/体重(LW/BW)和心重/胫骨长度(HW/TL)评估心肌重塑情况。结果1.心肌梗死后尾静脉注射raav载体可在体内稳定转导,WB显示人源VEGF165基因可在心肌组织中特异性表达,qPCR显示VEGF165和VEGFR2mRNA转录水平显著提高。2.尾静脉注射aav9-VEGF165治疗优于左西孟旦药物治疗,可更加客观显著改善心肌梗死小鼠心功能和生存率。3.小鼠行冠状动脉结扎4W后,心梗组与sham组相比,左室收缩功能各项指标分别下降;与EGFP组相比,VEGF组左室收缩功能显著提高,levo.组差异无统计学意义;与levo.组相比,VEGF组收缩功能改善明显。4.组织学评估显示,VEGF组和levo.组左室病理重塑在心梗后减弱,梗死面积均显著减小,心肌重塑指标显著降低,levo.组无统计学意义。5.免疫组织化学显示VEGF组毛细血管密度和细胞增殖增加,TUNEL阳性心肌细胞数量减少,左西孟旦

关键词：心肌梗死基因治疗 aav载体血管内皮生长因子(VEGF) 左西孟旦血管再生心室重构

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神经肌肉疾病基因治疗的研究进展

生命的化学 2022年第5期42卷 968-975页

作者：周鹏颜景斌上海市儿童医院上海医学遗传研究所上海交通大学附属儿童医院国家卫生健康委员会胚胎分子生物学重点实验室上海市胚胎与生殖工程重点实验室上海200040

神经肌肉疾病(neuromuscular diseases,NMD)是一类以运动单位受损、运动耐力下降、肌力减退为主要表现的中枢及周围神经疾病。长期以来,神经肌肉疾病的治疗手段主要是对症治疗,但仅能缓解症状,无法根治。腺相关病毒(adeno-associated vi... 详细信息

神经肌肉疾病(neuromuscular diseases,NMD)是一类以运动单位受损、运动耐力下降、肌力减退为主要表现的中枢及周围神经疾病。长期以来,神经肌肉疾病的治疗手段主要是对症治疗,但仅能缓解症状,无法根治。腺相关病毒(adeno-associated virus,aav)载体是经过基因工程改造过的转基因载体,由于其安全性好、免疫原性低、表达时间长,可以感染分裂细胞和非分裂细胞等特点,在基因治疗和疫苗研究中得到广泛应用。CRISPR/Cas9基因编辑系统由型CRISPR细菌免疫系统改进而来,具有靶向精确、脱靶率低、细胞毒性低等特点,是目前应用最为广泛的基因编辑工具。本综述总结了几种常见神经肌肉疾病的最新基因治疗进展,着重讨论了基于aav载体和CRISPR/Cas9系统的基因治疗在NMD治疗中的潜在价值以及相应的风险。

关键词：神经肌肉疾病基因治疗 aav载体 CRISPR/Cas9

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肝糖原积累病1例并文献复习

中文科技期刊数据库（引文版）医药卫生 2022年第5期 73-76页

作者：任丽艳上海交通大学医学院苏州九龙医院江苏苏州215127

肝糖原积累病(GSD)是一种常染色体隐性遗传性糖代谢障碍疾病,根据酶的缺陷不同和疾病发现时间早晚,糖原积累病主要分为13型,其中I型最为常见。临床上主要表现包括肝肿大、低血糖、乳酸血症、高脂血症、高尿酸血症和生长迟缓等。目前糖... 详细信息

肝糖原积累病(GSD)是一种常染色体隐性遗传性糖代谢障碍疾病,根据酶的缺陷不同和疾病发现时间早晚,糖原积累病主要分为13型,其中I型最为常见。临床上主要表现包括肝肿大、低血糖、乳酸血症、高脂血症、高尿酸血症和生长迟缓等。目前糖原积累病I型(GSD I)的诊断主要基于临床表现、生化异常、分子遗传学异常以及肝细胞活检等检查手段。目前肝糖原积累病的治疗仍以预防并减少低血糖发生为主,通过aav载体介导基因方法亦被开发用于GSD Ia的治疗,平稳降糖,严格控制碳水化合物的摄入量可以延缓GSD Ia的并发症。

关键词：肝糖原积累病低血糖 aav载体

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中华妇产科杂志 2005年第7期40卷 480-483页

作者：张娟林仲秋彭永排张丙忠周晖杨清元中山大学附属第二医院妇科广州510120

目的构建含人乳头状瘤病毒16型E7(HPV16E7)基因的重组腺相关病毒(raav)载体,并验证HPV16E7mRNA和蛋白在真核细胞中的表达。方法将含腺相关病毒(aav)末端反向重复序列及HPV16E7基因的重组质粒paavMCSE7、含rep/cap基因的质粒paavRC及辅... 详细信息

目的构建含人乳头状瘤病毒16型E7(HPV16E7)基因的重组腺相关病毒(raav)载体,并验证HPV16E7mRNA和蛋白在真核细胞中的表达。方法将含腺相关病毒(aav)末端反向重复序列及HPV16E7基因的重组质粒paavMCSE7、含rep/cap基因的质粒paavRC及辅助质粒paavhelper共同转染胚胎肾细胞系HEK293细胞,回收、纯化病毒颗粒并鉴定,斑点杂交法测定病毒滴度,RTPCR技术、蛋白印迹法验证HPV16E7mRNA和蛋白在真核细胞中的表达。结果电镜鉴定结果显示真核细胞中有病毒颗粒存在,斑点杂交法测定病毒滴度为1×1011/ml。含HPV16E7基因的raav载体转染真核细胞后,在细胞内可检测到HPV16E7mRNA和蛋白的表达。结论本实验成功构建了含HPV16E7基因的raav载体,经验证HPV16E7mRNA和蛋白在真核细胞内有表达。

关键词：人乳头状瘤病毒16型重组腺相关病毒载体真核细胞 mRNA HPV16E7基因 HEK293细胞 RT-PCR技术斑点杂交法 aav载体反向重复序列病毒颗粒病毒滴度蛋白印迹法重组质粒鉴定结果细胞内验证细胞系胚胎肾 p基因 rep

腺相关病毒载体介导造血干细胞基因转导的策略

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中华实验和临床病毒学杂志 2008年第6期22卷 516-517页

作者：赵卫红吴剑卿南京医科大学第一附属医院肾内科 210029 老年医学科

腺相关病毒（adeno-associated virus，aav）已被广泛用作基因治疗的载体。本文就提高aav载体在HSCs中的基因转导效率的策略综述如下。1自身互补的aav载体由单链基因组向有转录活性的双链形式的转变障碍限制了aav载体介导的基因转导。... 详细信息

腺相关病毒（adeno-associated virus，aav）已被广泛用作基因治疗的载体。本文就提高aav载体在HSCs中的基因转导效率的策略综述如下。1自身互补的aav载体由单链基因组向有转录活性的双链形式的转变障碍限制了aav载体介导的基因转导。自身互补双链DNA的aav载体（scaav）不需进行病毒DNA第二链的合成，大大提高了 aav的转导效率。

关键词：基因转导效率病毒载体介导造血干细胞 aav载体双链DNA 腺相关病毒病毒DNA 基因治疗

重组aav（raav）杆状病毒生产系统的研究

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重组AAV（rAAV）杆状病毒生产系统的研究

作者：雷求刚浙江理工大学

学位级别：硕士

腺相关病毒(Adeno-associated Viruses, aav)感染人体后不会产生致病性,通过去除病毒基因仅保留两端ITR序列进一步增加了重组aav载体的安全性,而且其携带的基因表达期比较长,因此在基因治疗领域越来越受到人们的关注。然而,传统的生产... 详细信息

腺相关病毒(Adeno-associated Viruses, aav)感染人体后不会产生致病性,通过去除病毒基因仅保留两端ITR序列进一步增加了重组aav载体的安全性,而且其携带的基因表达期比较长,因此在基因治疗领域越来越受到人们的关注。然而,传统的生产方式很难满足临床上对aav载体高产量的需求,这成为aav载体在临床应用上的一个重大瓶颈,探索一种高效、安全和可放大的生产方式以得到高产量的aav载体是满足其临床需求的必要条件。除了腺病毒和单纯疱疹病毒外,杆状病毒也能为aav的复制包装提供辅助功能,而且杆状病毒不会像腺病毒和单纯疱疹病毒一样对人体产生毒性,因此,利用杆状病毒携带aav包装所需的顺式和反式作用元件,借助杆状病毒对昆虫细胞Sf9的感染性,在昆虫细胞中生产重组aav载体,是一种较为理想且能满足临床需求的新型重组aav生产方式。重组aav的杆状病毒生产系统需要两类反式因子:一是aav的复制蛋白Rep78和Rep52,另外一类是aav的衣壳蛋白Cap1,Cap2和Cap3,可以由两个杆状病毒分别携带或者由单一的杆状病毒携带。该系统所需的另外一个顺式组分是携带aav2的ITR及外源表达框(如EGFP)的重组杆状病毒。根据aav2的Rep和Cap基因序列设计引物,PCR扩增Rep78、Rep52、Cap1及Cap2+3。Rep78和Cap2+3一组,Rep52和Cap1一组分别构建到pFastBacDual载体中。另外,我们借助一个能在昆虫细胞中起作用的内含子将Rep和Cap基因构建到一个同一载体中,借助内含子的作用,Rep表达框能同时表达Rep78和Rep52,而Cap表达框能同时表达Cap1和Cap2+3。将这几个载体分别转化DH10Bac?感受态通过转座重组得到重组Bacmid ,转染昆虫细胞得到重组杆状病毒Bac-aav2Rep78Cap2+3、Bac-aav2Rep52Cap1和Bac-aav2RepiCapi。采用类似的方法得到重组杆状病毒Bac-aav2EGFP。其中,Bac-aav2Rep78Cap2+3, Bac-aav2Rep52Cap1和Bac-aav2EGFP共感染Sf9细胞构成三杆状病毒生产系统,Bac-aav2RepiCapi和Bac-aav2EGFP共感染Sf9细胞构成两杆状病毒生产系统,两套系统分别用来生产带EGFP的重组aav2载体raav2-EGFP。经初步研究证明,三杆状病毒系统和二杆状病毒系统都能成功包装出raav2-EGFP病毒。生产出的病毒经aav纯化试剂盒纯化,通过定量PCR检测病毒载体基因组产量,结果显示:三杆状病毒生产能力为每个Sf9细胞4.85×103VG(Virus vector genomes,病毒载体基因组),而二杆状病毒达到了每个Sf9细胞6.12×10VG。进一步转导HEK293细胞后经流式细胞仪检测:前者生产能力为每个Sf9细胞3TU (Transduction Unit,转导单位),后者则达到30TU左右,且感染HEK293细胞后都能看到较强的绿色荧光表达,说明病毒活力较强。从各项检测的结果来看,二杆状病毒系统的生产能力更强,如果将其放大到较大规模的悬浮培养生产方式,产量和生产效率将得到极大提高。因此,杆状病毒生产系统这种高效、安全、可放大的生产方式大大简化了生产过程,降低了生产成本,能够满足基因治疗和临床上对aav产量的需求。

关键词： aav载体杆状病毒 raav2-EGFP 病毒生产