重组AAV（rAAV）杆状病毒生产系统的研究

作     者：雷求刚 

作者单位：浙江理工大学 

学位级别：硕士

导师姓名：钱其军

授予年度：2010年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：AAV载体 杆状病毒 rAAV2-EGFP 病毒生产 

摘      要：腺相关病毒(Adeno-associated Viruses, AAV)感染人体后不会产生致病性,通过去除病毒基因仅保留两端ITR序列进一步增加了重组AAV载体的安全性,而且其携带的基因表达期比较长,因此在基因治疗领域越来越受到人们的关注。然而,传统的生产方式很难满足临床上对AAV载体高产量的需求,这成为AAV载体在临床应用上的一个重大瓶颈,探索一种高效、安全和可放大的生产方式以得到高产量的AAV载体是满足其临床需求的必要条件。 除了腺病毒和单纯疱疹病毒外,杆状病毒也能为AAV的复制包装提供辅助功能,而且杆状病毒不会像腺病毒和单纯疱疹病毒一样对人体产生毒性,因此,利用杆状病毒携带AAV包装所需的顺式和反式作用元件,借助杆状病毒对昆虫细胞Sf9的感染性,在昆虫细胞中生产重组AAV载体,是一种较为理想且能满足临床需求的新型重组AAV生产方式。 重组AAV的杆状病毒生产系统需要两类反式因子:一是AAV的复制蛋白Rep78和Rep52,另外一类是AAV的衣壳蛋白Cap1,Cap2和Cap3,可以由两个杆状病毒分别携带或者由单一的杆状病毒携带。该系统所需的另外一个顺式组分是携带AAV2的ITR及外源表达框(如EGFP)的重组杆状病毒。 根据AAV2的Rep和Cap基因序列设计引物,PCR扩增Rep78、Rep52、Cap1及Cap2+3。Rep78和Cap2+3一组,Rep52和Cap1一组分别构建到pFastBacDual载体中。另外,我们借助一个能在昆虫细胞中起作用的内含子将Rep和Cap基因构建到一个同一载体中,借助内含子的作用,Rep表达框能同时表达Rep78和Rep52,而Cap表达框能同时表达Cap1和Cap2+3。将这几个载体分别转化DH10Bac?感受态通过转座重组得到重组Bacmid ,转染昆虫细胞得到重组杆状病毒Bac-AAV2Rep78Cap2+3、Bac-AAV2Rep52Cap1和Bac-AAV2RepiCapi。采用类似的方法得到重组杆状病毒Bac-AAV2EGFP。其中,Bac-AAV2Rep78Cap2+3, Bac-AAV2Rep52Cap1和Bac-AAV2EGFP共感染Sf9细胞构成三杆状病毒生产系统,Bac-AAV2RepiCapi和Bac-AAV2EGFP共感染Sf9细胞构成两杆状病毒生产系统,两套系统分别用来生产带EGFP的重组AAV2载体rAAV2-EGFP。 经初步研究证明,三杆状病毒系统和二杆状病毒系统都能成功包装出rAAV2-EGFP病毒。生产出的病毒经AAV纯化试剂盒纯化,通过定量PCR检测病毒载体基因组产量,结果显示:三杆状病毒生产能力为每个Sf9细胞4.85×103VG(Virus vector genomes,病毒载体基因组),而二杆状病毒达到了每个Sf9细胞6.12×10VG。进一步转导HEK293细胞后经流式细胞仪检测:前者生产能力为每个Sf9细胞3TU (Transduction Unit,转导单位),后者则达到30TU左右,且感染HEK293细胞后都能看到较强的绿色荧光表达,说明病毒活力较强。从各项检测的结果来看,二杆状病毒系统的生产能力更强,如果将其放大到较大规模的悬浮培养生产方式,产量和生产效率将得到极大提高。因此,杆状病毒生产系统这种高效、安全、可放大的生产方式大大简化了生产过程,降低了生产成本,能够满足基因治疗和临床上对AAV产量的需求。