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来源于枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶的克隆表达、转糖基性能及其产物活性评价研究

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来源于枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶的克隆表达、转糖基性能及其产物...

作者：吴元元合肥工业大学

学位级别：硕士

果聚糖蔗糖酶是一类属于糖苷酶68家族的糖基转移酶,能够以蔗糖为底物发生催化反应。基于受体的不同,可以发生水解、聚合和转糖基反应,特别是利用该酶的转糖基性能催化制备功能性低聚糖,已成为糖工程领域的研究热点,在食品、制药、农业... 详细信息

果聚糖蔗糖酶是一类属于糖苷酶68家族的糖基转移酶,能够以蔗糖为底物发生催化反应。基于受体的不同,可以发生水解、聚合和转糖基反应,特别是利用该酶的转糖基性能催化制备功能性低聚糖,已成为糖工程领域的研究热点,在食品、制药、农业等领域有着广阔的市场前景。本课题对来自于Bacillus subtilis的果聚糖蔗糖酶(LRS)基因与载体p ET-28a(+)进行重组,并转入*** BL21(DE3)中高效表达,获得基因工程菌*** BL21(DE3)/p ET-28a(+)-LRS。本文主要从以下方面对LRS进行探究:包括LRS的基因克隆表达、酶学性质以及LRS的转糖基性能及其催化产物生物活性评价等。LRS酶学性质结果表明,最适温度为50℃,在50℃下孵育90 min,酶活力仍为原始酶活的88%;最适p H为5.5,在p H为6.0时孵育24 h,酶活力是原始酶活力的95%,说明该酶有较好的稳定性。Mn和Ca对酶活力促进作用明显,Cu和SDS对酶活有抑制作用。在以蔗糖为底物时,K和V值分别为22.06 mmol/L和6.4μmol/(L·s),表明该酶对蔗糖有较好的亲和力。以蔗糖为底物催化制备分子量均一的β-(2,6)糖苷键的果聚糖时,蔗糖转化率可达63.56%。LRS具有转糖基功能,利用转糖基性能合成功能性低聚糖意义重大。确定了以乳糖为糖基受体,通过HPLC、MS、NMR等表征产物结构。并对催化工艺进行优化,确定最佳合成条件为300 m M蔗糖和300 m M乳糖,35℃下,p H为6.0时,酶浓度为5 U/m L,反应12 h,乳果三糖的最终产量为182 m M。评价乳果三糖能否促进益生菌增殖、有无细胞毒性、抗炎活性等生理功能,发酵实验结果表明,乳果三糖可以显著促进双歧杆菌、乳杆菌增殖及产酸,且增殖与产酸能力均强于低聚半乳糖和乳果糖,并且通过气相色谱测定发酵液中短链脂肪酸含量,发现乳酸和乙酸含量较高,有利于肠道代谢。MTT实验结果表明,当乳果三糖浓度小于25 mg/m L时,对细胞几乎没有毒性。脂多糖诱导细胞炎症模型发现,当乳果三糖的浓度为10 mg/m L时,可显著下调促炎细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-αm RNA的表达,具有较为明显的抗炎作用。本研究通过果聚糖蔗糖酶的转糖基功能合成功能性低聚糖,为果聚糖蔗糖酶更好地应用于生产提供基础,同时为单一聚合度低聚糖的制备提供参考。

关键词：功能性低聚糖果聚糖蔗糖酶克隆表达转糖基益生菌

北极海单胞菌β-半乳糖苷酶的原核表达及其转糖基活性检测

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北极海单胞菌β-半乳糖苷酶的原核表达及其转糖基活性检测

作者：周莉莉华东理工大学

学位级别：硕士

本实验对一株来源于北冰洋海冰样品的海单胞菌BSi20414的β-半乳糖苷酶基因galm重组质粒进行二次构建,得到准确的p-半乳糖苷酶基因和重组菌株。利用hiTAIL-PCR方法对同属另一株菌BSi20584的β-半乳糖苷酶基因进行克隆,命名为galt。随后... 详细信息

本实验对一株来源于北冰洋海冰样品的海单胞菌BSi20414的β-半乳糖苷酶基因galm重组质粒进行二次构建,得到准确的p-半乳糖苷酶基因和重组菌株。利用hiTAIL-PCR方法对同属另一株菌BSi20584的β-半乳糖苷酶基因进行克隆,命名为galt。随后对两种p-半乳糖苷酶进行了比对,发现序列相似度为88.41%。与其他来源已研究的β-半乳糖苷酶基因序列比对后初步确定galm活性中心两个关键残基位点--酸碱位点和亲和位点分别为14位Glu,314位的Glu。将菌株BSi20414的β-半乳糖苷酶基因进行原核表达并优化表达条件。实验发现重组菌OD为0.7-0.9时加入IPTG至终浓度为0.1mM,20℃摇床诱导22h,SDS-PAGE电泳显示重组蛋白的表达量最大。随后利用镍柱亲和层析和凝胶过滤两步层析对重组p-半乳糖苷酶进行分离纯化,测定重组p-半乳糖苷酶的主要酶学性质。实验测定的重组p-半乳糖苷酶最适酶活温度和最适酶活pH分别为60℃、6-7,与天然β-半乳糖苷酶最适酶活温度,最适酶活pH类似。重组β-半乳糖苷酶在50℃条件下1h后能保持酶活90%以上60℃时能保持最大酶活的60%以上。在60℃条件下测定了重组β-半乳糖苷酶对ONPG和乳糖的水解动力学曲线,前者Km和Vmax分别为2.27mmol/1,18.14μmol/lmin,后者Km和Vmax分别为176.865mmol/l,0.312mol/lmin,对ONPG的亲和性大于乳糖。实验对BSi20414菌株重组β-半乳糖苷酶的转糖基性质进行了检测,TLC实验显示重组p-半乳糖苷酶有转糖基活性且有功能性产物。随后利用凝胶柱和半制备型HPLC对转糖基产物进行分离纯化,得到三个组分ZLL-01、ZLL-02、ZLL-03,送测质谱跟核磁检测确定结构。ZLL-01初步确定为二糖,ZLL-02组分为三糖,结构为p-Gal-(1→4)-[β-Gal(1→3)]-Glc。

关键词： β-半乳糖苷酶表达转糖基低聚半乳糖

耐高温β-糖苷酶的乳糖水解活性及转糖基活性

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生物加工过程 2009年第1期7卷 49-53页

作者：王卿卿冯惠勇康辉卢楠张丽丽河北科技大学生物科学与工程学院石家庄050018 河北中润制药有限公司石家庄056017 河北化工医药职业技术学院石家庄050000

β-糖苷酶(ttβGLY)是Thermus thermophilus产生的一种耐高温酶,以乳糖为底物的酶反应研究表明:该酶具有较高的乳糖水解活性,其最适温度为70℃,最适pH为7.0,乳糖水解的Km=1.566 mmol/L,Vm ax=0.406 mmol/m in,在70℃有较好的热稳定性。... 详细信息

β-糖苷酶(ttβGLY)是Thermus thermophilus产生的一种耐高温酶,以乳糖为底物的酶反应研究表明:该酶具有较高的乳糖水解活性,其最适温度为70℃,最适pH为7.0,乳糖水解的Km=1.566 mmol/L,Vm ax=0.406 mmol/m in,在70℃有较好的热稳定性。该酶同时具有较强的转糖基活性,在以40%乳糖为底物,加酶量42.5 U/mL、反应温度70℃、反应时间16 h的条件下,低聚半乳糖的合成率达到35.3%。水解产物葡萄糖对乳糖水解反应和转糖基反应具有抑制作用,是影响GOS合成的重要因素。

关键词： β-糖苷酶低聚半乳糖水解转糖基

通过酶法转糖基提高咖啡酸苯乙酯的抗炎活性和水溶性

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通过酶法转糖基提高咖啡酸苯乙酯的抗炎活性和水溶性

β-N-乙酰氨基己糖苷酶定向进化及其转糖基活性提高

第十二届中国酶工程学术研讨会

作者：余晓琴张洪斌杨静文合肥工业大学食品与生物工程学院

酶法糖基化是提高天然化合物的生物活性和理化性质并用于治疗药物开发的一种有效策略。本研究以咖啡酸苯乙酯为糖基受体,蔗糖为糖基供体,在来自Leuconostoc mesenteroides 0326的右旋糖酐蔗糖酶的催化下进行转糖基化反应,合成了两种咖... 详细信息

酶法糖基化是提高天然化合物的生物活性和理化性质并用于治疗药物开发的一种有效策略。本研究以咖啡酸苯乙酯为糖基受体,蔗糖为糖基供体,在来自Leuconostoc mesenteroides 0326的右旋糖酐蔗糖酶的催化下进行转糖基化反应,合成了两种咖啡酸苯乙酯糖苷（G-CAPE和2G-CAPE）。对两组产物进行纯化后,测定了两种咖啡酸苯乙酯糖苷产物的结构、理化性质、抗炎活性和细胞毒性。GCAPE和2G-CAPE的水溶性分别是咖啡酸苯乙酯的35倍和90倍。与咖啡酸苯乙酯相比,其单糖苷产物具有更显著的抗炎作用,在RAW 264.7巨噬细胞中,20μM的G-CAPE对NO,IF-6,和TNF-α的抑制率分别是93.4%,76.81%和56.58%。此外,两种咖啡酸苯乙酯糖苷的细胞毒性均有明显改善。因此,与未糖基化的咖啡酸苯乙酯相比,G-CAPE和2G-CAPE具有较好的抗炎效果和较低的生物毒性,可应用于抗炎药物。

关键词：咖啡酸苯乙酯右旋糖酐蔗糖酶转糖基抗炎

来源： cnki会议评论

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β-N-乙酰氨基己糖苷酶定向进化及其转糖基活性提高

一株曲霉果糖转移酶的发酵条件及转果糖基活性

中国生物工程学会第十届学术年会暨2016年全国生物技术大会

作者：陈晓迪卢丽丽徐莉肖敏山东大学微生物技术国家重点实验室山东大学国家糖工程技术研究中心山东省糖化学与糖生物学省级重点实验室

β-N-乙酰氨基已糖苷酶(β-N-acetylhexosaminidases,EC.3.***.1.52)是一类重要的糖苷水解酶,广泛分布于动物、植物和微生物中,催化β-N-乙酰氨基糖苷键的水解。根据酶的氨基酸序列相似性,β-N-乙酰氨基已糖苷酶分布在糖苷酶家族GH3、GH20... 详细信息

β-N-乙酰氨基已糖苷酶(β-N-acetylhexosaminidases,EC.3.***.1.52)是一类重要的糖苷水解酶,广泛分布于动物、植物和微生物中,催化β-N-乙酰氨基糖苷键的水解。根据酶的氨基酸序列相似性,β-N-乙酰氨基已糖苷酶分布在糖苷酶家族GH3、GH20、GH84和GH123中,其中,多数GH20的β-N-乙酰氨基已糖苷酶具有水解β-N-乙酰氨基半乳糖苷及β-N-乙酰氨基葡萄糖苷化合物底物(GalNAc-and GlcNAc-containing substrates)的双功能。近年的研究发现某些β-N-乙酰氨基已糖苷酶在体外合适的反应条件下具有转β-N-乙酰氨基已糖基的活性,合成重要N-乙酰氨基已糖苷化合物,但转糖基合成产率均小于10%,且表现出比较低的区域选择性(regioselectivity),导致产物存在复杂的的同分异构体,难以分离。实验室前期工作从双歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)JCM1254获得的β-N-乙酰氨基己糖苷酶BbhI能够以乳糖为底物催化合成55.4%的GalNAc-β-1, 3-Lactose及44.9%的GlcNAc-β-1, 3-Lactose,该合成反应区域选择性专一,是目前已经报道的细菌来源β-N-乙酰氨基己糖苷酶中催化合成该化合物产率最高的糖苷酶。本研究对β-N-乙酰氨基己糖苷酶BbhI进行了定向进化,以获得转糖基活性更高的糖苷酶突变体,用以寡糖的酶催化合成反应。首先采用大引物易错PCR对BbhI酶基因进行特定区域的高效率随机突变,通过对1300个突变酶的转糖基产量的TLC初步筛选,获得了25个转糖基活性提高的突变酶,经HPLC定量分析,其中3个突变酶RM4、RM34和RM125的转糖基产率分别由原始酶的44%提高到了70%、68和65%;测序发现突变酶RM4和RM125各包含了5个突变位点,RM34包含了9个突变位点,其中RM34和RM125都包含D714位点的突变;对突变酶RM4和RM34单点突变进行分析,结果显示位点W773和D714对转糖基产率的提高作用明显,进一步对这两个位点进行了点饱和突变,获得两个单点突变酶W773R和D714T的转糖基产率从原始酶的44%分别提高到81%和84%。生物信息学分析W773R和D714T两个突变酶的结构在催化域外侧的柔性区域表现出显著改变,核磁分析显示W773R和D714T较原始酶对受体的亲和力更高。本研究获得的突变酶W773R和D714T为GalNAc-β-1, 3及GlcNAc-β-1, 3键寡糖的高效合成奠定了基础,对于催化合成β-GalNAc/GlcNAc-β-1, 3-寡糖、开发其医药价值有着重要的意义。

关键词： β-N-乙酰氨基已糖苷酶随机突变转糖基

来源： cnki会议评论

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食品与生物技术学报 2006年第2期25卷 52-55页

作者：王立梅周惠明江南大学食品学院江苏无锡214036

对一株曲霉果糖转移酶菌株的产酶培养条件进行了研究。确定了最佳培养基组成：初始蔗糖质量浓度15～18g／dL，氮源为酵母膏，K2HPO4对果糖转移酶的产生具有明显的促进作用，添加0．2g／dLCMC能够使果糖转移酶活力提高到原来的1．3倍，在... 详细信息

对一株曲霉果糖转移酶菌株的产酶培养条件进行了研究。确定了最佳培养基组成：初始蔗糖质量浓度15～18g／dL，氮源为酵母膏，K2HPO4对果糖转移酶的产生具有明显的促进作用，添加0．2g／dLCMC能够使果糖转移酶活力提高到原来的1．3倍，在pH5．5，30℃条件下，果糖转移酶最高酶活力为30．42U／mL。HPLC分析结果表明，转糖基产物为总质量的55．8％。

关键词：果糖转移酶转糖基酶活力生物量

基于右旋糖酐蔗糖酶转糖基作用的槲皮素葡萄糖苷的合成研究

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生物学杂志 2014年第5期31卷 93-98页

作者：任亮张洪斌胡雪芹牛博艺合肥工业大学制药工程系合肥230009

右旋糖酐蔗糖酶是一种以蔗糖为唯一底物,将蔗糖分子中D-葡萄糖基催化转移到受体分子上的葡萄糖基转移酶。利用右旋糖酐蔗糖酶的转糖基作用,以蔗糖为葡萄糖糖基供体,槲皮素为糖基受体,对槲皮素糖苷的酶法合成进行了探索。通过对该酶催化... 详细信息

右旋糖酐蔗糖酶是一种以蔗糖为唯一底物,将蔗糖分子中D-葡萄糖基催化转移到受体分子上的葡萄糖基转移酶。利用右旋糖酐蔗糖酶的转糖基作用,以蔗糖为葡萄糖糖基供体,槲皮素为糖基受体,对槲皮素糖苷的酶法合成进行了探索。通过对该酶催化反应体系、催化反应条件及产物分析的研究,结果表明:在25°C下,右旋糖酐蔗糖酶能够在30%DMSO-70%乙酸-乙酸钙(0.02 mol/L,pH值5.4)的反应体系中催化合成一种槲皮素葡萄糖苷,在这个反应体系下,以10%的蔗糖作为糖基供体,槲皮素为糖基受体,右旋糖酐蔗糖酶活力为40 U/mL,转速为150 r/min,槲皮素糖苷的转化率最高,可达39.5%。通过质谱分析确定是一种槲皮素单糖苷,分子量为464。该研究结果为黄酮类物质的糖基化修饰奠定了基础。

关键词：右旋糖酐蔗糖酶转糖基槲皮素槲皮素葡萄糖苷

通过截断和受体位点定点改造研究右旋糖酐蔗糖酶对小分子非碳水化合物的转糖基作用

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通过截断和受体位点定点改造研究右旋糖酐蔗糖酶对小分子非碳水化...

产β-半乳糖苷酶乳酸菌的筛选及酶法合成低聚半乳糖的GC-MS分析

第十一届中国酶工程学术研讨会

作者：李瑶张洪斌胡雪芹杨静文合肥工业大学生物与医学工程学院

本实验室通过克隆拷贝肠膜状明串珠菌Leuconostoc mesenteroides 0326的右旋糖酐蔗糖酶dextransucrase（EC 2.***.1.5）的基因dex-YG,构建右旋糖酐蔗糖酶大肠杆菌表达体系的工程菌。右旋糖酐蔗糖酶以蔗糖为底物通过水解转移葡萄糖基合成... 详细信息

本实验室通过克隆拷贝肠膜状明串珠菌Leuconostoc mesenteroides 0326的右旋糖酐蔗糖酶dextransucrase（EC 2.***.1.5）的基因dex-YG,构建右旋糖酐蔗糖酶大肠杆菌表达体系的工程菌。右旋糖酐蔗糖酶以蔗糖为底物通过水解转移葡萄糖基合成高分子葡聚糖。本文通过对右旋糖酐蔗糖酶基因dex-YG进行截短,受体结合相关位点的突变改造,对右旋糖酐蔗糖酶结构功能进行探究同时扩大其应用领域。以右旋糖酐蔗糖酶基因序列dex-YG为基础,通过生物信息的学比对分析,对其二级结构以及三级结构进行预测分析,对其C端序列进行一系列的截短,分析其结构功能的关系。通过片段截短的方法对其糖链延伸的控制,寡聚糖合成区域,以及完全保守区域进行了研究分析。对其末端重复序列删除,会极大的影响其合成葡聚糖的能力,截短片段长度增加,其合成高分子葡聚糖的能力急剧下降,在一定长度的截短后,其右旋糖酐的合成能力完全丧失。反应极大的偏向受体反应,从而起寡聚糖的合成能力显著提升,随着更进一步的片段截短直至其保守序列motif I,其受体反应的催化性能也极具下降,其酶活力几乎完全丧失。其中通过截短C-端1494 bp片段,得到剩余1-3087 bp基因片段的DSR-S1-△A突变酶。对其进行酶学性质研究表明,DSR-S1-△A酶在没有受体情况下,酶活完全丧失,受体存在时,DSR-S1-△A酶活是原始酶酶活的71.4%,其中糖基转移活性是水解活性的5.3倍,其主要活性为转糖基功能,多糖聚合能力低。通过用麦芽糖、纤维二糖、棉子糖和水苏糖等不同糖类和多个非糖类小分子为转糖基受体的转糖基研究表明:麦芽糖是该酶转糖基反应的最佳受体,同时对纤维二糖、棉子三糖和水苏糖都有活性,但转糖基依次减弱;不同天然低聚糖的转糖基反应都趋向于生成低分子量的糖,转移1-2个葡萄糖基到受体分子,并且受体分子量越小越易进行转糖基作用非碳水化合物小分子为受体底物;可利用Vc为转糖基受体进行转糖基反应,得到Vc葡萄糖衍生物,正在进行对其产物的进一步研究。此外本实验在之前对右旋糖酐蔗糖酶基因序列dex-YG二级三级预测分析的基础上,结合相关家族酶的目前的研究基础,在预测的受体结合位点进行突变改造,进一步探究此酶结构与转糖基功能间关系,以期得到对更多的非碳水化合物药用分子有转糖基作用的工程菌,从而制备药用分子的糖苷衍生物,改变其原来天然化合物的理化性质,提高生物利用度。目前已初步完成了突变体的构建和部分工程菌的筛选。综上,本研究明确了右旋糖酐蔗糖酶转糖基功能的分子区域,有助于进一步认识右旋糖酐蔗糖酶的催化机制;同时对于非碳水化合物药用分子的糖基化研究具有重要意义。

关键词：右旋糖酐蔗糖酶截短定点突变转糖基非碳水化合物

来源： cnki会议评论

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现代食品科技 2015年第12期31卷 355-361页

作者：张宏志马艳弘黄开红李亚辉江苏省农业科学院农产品加工研究所江苏南京210014

从分离自13种中国传统发酵食品的148株乳酸菌中筛选产高转糖基活性β-半乳糖苷酶的菌株。实验采用X-Gal平板初筛、薄层层析(TLC)复筛、气相色谱(GC)定量的方法,得到一株产β-半乳糖苷酶转糖基活性最高的菌株,并以乳糖为单底物,利用该高... 详细信息

从分离自13种中国传统发酵食品的148株乳酸菌中筛选产高转糖基活性β-半乳糖苷酶的菌株。实验采用X-Gal平板初筛、薄层层析(TLC)复筛、气相色谱(GC)定量的方法,得到一株产β-半乳糖苷酶转糖基活性最高的菌株,并以乳糖为单底物,利用该高转糖基活性β-半乳糖苷酶酶法合成低聚半乳糖(GOS),并采用GC-MS的方法对其各个组分进行鉴定。研究结果表明,菌株70810所产β-半乳糖苷酶转糖基活性最高,其合成GOS产率达到39.23%(m/m);该菌株为实验室已鉴定乳酸菌,为植物乳杆菌(HQ259238)(Lactobacillus plantarum);酶法合成的GOS产物鉴定为9种低聚二糖和3种低聚三糖,主要结构多为β(1→6)和β(1→3)糖苷键。菌株70810来源于泡菜,安全性好,所产β-半乳糖苷酶转糖基活性最高,且可不经纯化直接利用,在食品与乳品加工等方面将具有很好的应用前景。

关键词： β-半乳糖苷酶转糖基乳酸菌低聚半乳糖气质联用仪(GC-MS)