北极海单胞菌β-半乳糖苷酶的原核表达及其转糖基活性检测

作     者：周莉莉 

作者单位：华东理工大学 

学位级别：硕士

导师姓名：陈波

授予年度：2013年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：β-半乳糖苷酶 表达 转糖基 低聚半乳糖 

摘      要：本实验对一株来源于北冰洋海冰样品的海单胞菌BSi20414的β-半乳糖苷酶基因galm重组质粒进行二次构建,得到准确的p-半乳糖苷酶基因和重组菌株。利用hiTAIL-PCR方法对同属另一株菌BSi20584的β-半乳糖苷酶基因进行克隆,命名为galt。随后对两种p-半乳糖苷酶进行了比对,发现序列相似度为88.41%。与其他来源已研究的β-半乳糖苷酶基因序列比对后初步确定galm活性中心两个关键残基位点--酸碱位点和亲和位点分别为14位Glu,314位的Glu。 将菌株BSi20414的β-半乳糖苷酶基因进行原核表达并优化表达条件。实验发现重组菌OD为0.7-0.9时加入IPTG至终浓度为0.1mM,20℃摇床诱导22h,SDS-PAGE电泳显示重组蛋白的表达量最大。随后利用镍柱亲和层析和凝胶过滤两步层析对重组p-半乳糖苷酶进行分离纯化,测定重组p-半乳糖苷酶的主要酶学性质。实验测定的重组p-半乳糖苷酶最适酶活温度和最适酶活pH分别为60℃、6-7,与天然β-半乳糖苷酶最适酶活温度,最适酶活pH类似。重组β-半乳糖苷酶在50℃条件下1h后能保持酶活90%以上60℃时能保持最大酶活的60%以上。在60℃条件下测定了重组β-半乳糖苷酶对ONPG和乳糖的水解动力学曲线,前者Km和Vmax分别为2.27mmol/1,18.14μmol/lmin,后者Km和Vmax分别为176.865mmol/l,0.312mol/lmin,对ONPG的亲和性大于乳糖。 实验对BSi20414菌株重组β-半乳糖苷酶的转糖基性质进行了检测,TLC实验显示重组p-半乳糖苷酶有转糖基活性且有功能性产物。随后利用凝胶柱和半制备型HPLC对转糖基产物进行分离纯化,得到三个组分ZLL-01、ZLL-02、ZLL-03,送测质谱跟核磁检测确定结构。ZLL-01初步确定为二糖,ZLL-02组分为三糖,结构为p-Gal-(1→4)-[β-Gal(1→3)]-Glc。