β-N-乙酰氨基己糖苷酶定向进化及其转糖基活性提高
作者单位：山东大学微生物技术国家重点实验室 山东大学国家糖工程技术研究中心山东省糖化学与糖生物学省级重点实验室
会议名称：《中国生物工程学会第十届学术年会暨2016年全国生物技术大会》
会议日期：2016年
学科分类：08[工学] 082203[工学-发酵工程] 0822[工学-轻工技术与工程]
关 键 词：β-N-乙酰氨基已糖苷酶 随机突变 转糖基
摘 要：β-N-乙酰氨基已糖苷酶(β-N-acetylhexosaminidases,EC.3.***.1.52)是一类重要的糖苷水解酶,广泛分布于动物、植物和微生物中,催化β-N-乙酰氨基糖苷键的水解。根据酶的氨基酸序列相似性,β-N-乙酰氨基已糖苷酶分布在糖苷酶家族GH3、GH20、GH84和GH123中,其中,多数GH20的β-N-乙酰氨基已糖苷酶具有水解β-N-乙酰氨基半乳糖苷及β-N-乙酰氨基葡萄糖苷化合物底物(GalNAc-and GlcNAc-containing substrates)的双功能。近年的研究发现某些β-N-乙酰氨基已糖苷酶在体外合适的反应条件下具有转β-N-乙酰氨基已糖基的活性,合成重要N-乙酰氨基已糖苷化合物,但转糖基合成产率均小于10%,且表现出比较低的区域选择性(regioselectivity),导致产物存在复杂的的同分异构体,难以分离。实验室前期工作从双歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)JCM1254获得的β-N-乙酰氨基己糖苷酶BbhI能够以乳糖为底物催化合成55.4%的GalNAc-β-1, 3-Lactose及44.9%的GlcNAc-β-1, 3-Lactose,该合成反应区域选择性专一,是目前已经报道的细菌来源β-N-乙酰氨基己糖苷酶中催化合成该化合物产率最高的糖苷酶。本研究对β-N-乙酰氨基己糖苷酶BbhI进行了定向进化,以获得转糖基活性更高的糖苷酶突变体,用以寡糖的酶催化合成反应。首先采用大引物易错PCR对BbhI酶基因进行特定区域的高效率随机突变,通过对1300个突变酶的转糖基产量的TLC初步筛选,获得了25个转糖基活性提高的突变酶,经HPLC定量分析,其中3个突变酶RM4、RM34和RM125的转糖基产率分别由原始酶的44%提高到了70%、68和65%;测序发现突变酶RM4和RM125各包含了5个突变位点,RM34包含了9个突变位点,其中RM34和RM125都包含D714位点的突变;对突变酶RM4和RM34单点突变进行分析,结果显示位点W773和D714对转糖基产率的提高作用明显,进一步对这两个位点进行了点饱和突变,获得两个单点突变酶W773R和D714T的转糖基产率从原始酶的44%分别提高到81%和84%。生物信息学分析W773R和D714T两个突变酶的结构在催化域外侧的柔性区域表现出显著改变,核磁分析显示W773R和D714T较原始酶对受体的亲和力更高。本研究获得的突变酶W773R和D714T为GalNAc-β-1, 3及GlcNAc-β-1, 3键寡糖的高效合成奠定了基础,对于催化合成β-GalNAc/GlcNAc-β-1, 3-寡糖、开发其医药价值有着重要的意义。