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脂质体与蛋白质共价偶联的碳二亚胺法

免疫学杂志 1999年第2期15卷 125-127页

作者：罗招凡刘剑雄范侠中山医科大学孙逸仙纪念医院检验科湖北医科大学第一附属医院检验科

报道脂质体与蛋白类物质胰岛素共价偶联的碳二亚胺（ＥＤＣＩ）法，取一定量脂质体、ＥＤＣＩ及胰岛素液，ｐＨ７．４、２４°Ｃ条件下充分反应２ｈ，用低温高速离心使脂质体－胰岛素复合物与游离胰岛素分开，并将本法与戊二醛法作了比... 详细信息

报道脂质体与蛋白类物质胰岛素共价偶联的碳二亚胺（ＥＤＣＩ）法，取一定量脂质体、ＥＤＣＩ及胰岛素液，ｐＨ７．４、２４°Ｃ条件下充分反应２ｈ，用低温高速离心使脂质体－胰岛素复合物与游离胰岛素分开，并将本法与戊二醛法作了比较。结果：碳二亚胺首先与胰岛素上的羧基反应生成一加成中间产物，然后再与脂质体上的氨基反应生成酰胺键，实现两者的交联。ＥＤＣＩ法高效、方便，是一种较好的将蛋白类物质偶联于脂质体上的化学方法。

关键词：脂质体碳二亚胺法蛋白质共价偶联

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苄非他明人工抗原合成

中国生物工程杂志 2021年第7期41卷 58-65页

作者：康可人袁强梁飞敏伍丽贤广州万孚生物技术股份有限公司广州510663 广州正孚检测有限公司广东正孚法医毒物司法鉴定所广州510663

目的:通过化学方法对苄非他明进行结构修饰并保留抗原决定簇,将结构改造后的产物与载体偶联合成苄非他明抗原。方法:苄非他明经化学修饰后,增加活性基团连接上一类可用的经化学修饰的连接臂,使用碳二亚胺法与载体蛋白偶联成苄非他明人... 详细信息

目的:通过化学方法对苄非他明进行结构修饰并保留抗原决定簇,将结构改造后的产物与载体偶联合成苄非他明抗原。方法:苄非他明经化学修饰后,增加活性基团连接上一类可用的经化学修饰的连接臂,使用碳二亚胺法与载体蛋白偶联成苄非他明人工合成抗原。该抗原通过紫外吸收光光谱扫描技术、SDS-PAGE电泳法及胶体金免疫层析法进行偶联效果和抗原活性的鉴定。结果:苄非他明半抗原结构与载体偶联成功,该抗原具有较高的纯度和活性,与苄非他明抗体反应表现出较高的特异性。结论:该方法合成的苄非他明抗原可用于免疫检测方法,也可作免疫原制备相关抗体。

关键词：苄非他明人工抗原碳二亚胺法免疫检测

低强度聚焦超声触发载药相变纳米粒溶栓的体内外实验研究

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低强度聚焦超声触发载药相变纳米粒溶栓的体内外实验研究

作者：胡柳重庆医科大学

学位级别：硕士

第一部分载药相变型纳米粒的制备及理化性质检测目的:制备一种靶向纤维蛋白的载药相变型纳米粒,并检测其理化性质。方法:采用三步乳化法和碳二亚胺法制备以聚乳酸羟基乙酸（PLGA）为载体,包含重组组织型纤溶酶原激活剂（rt PA）和全氟... 详细信息

第一部分载药相变型纳米粒的制备及理化性质检测目的:制备一种靶向纤维蛋白的载药相变型纳米粒,并检测其理化性质。方法:采用三步乳化法和碳二亚胺法制备以聚乳酸羟基乙酸（PLGA）为载体,包含重组组织型纤溶酶原激活剂（rt PA）和全氟己烷（PFH）,并连接CREKA多肽的纳米粒（PLGA-PFH-rt PA-CREKA nanoparticles,PPr C NPs）,并使用透射电子显微镜观察PPr C NPs的形貌结构,动态光散射法检测纳米粒的粒径、zeta电位,聚合物分散指数（PDI）以及稳定性。傅里叶红外验证CREKA多肽的氨基和PLGA的羧基脱水缩合形成的酰胺键的形成。流式细胞术半定量分析CREKA携带的数量。结果:成功制备PLGA-PFH-rt PA-CREKA纳米粒,透射电镜显示纳米粒均匀,呈球形,且无聚集现象。激光粒径仪显示纳米粒粒径为209.09±3.01 nm,电位为-6.37±0.18 m V,多分散系数为0.07±0.05,傅里叶红外结果显示PLGA表面的羧基端和CREKA的氨基端发生脱水缩合表明酰胺键的成功连接。流式细胞术显示CREKA的携带率为83.45%。结论:通过三步乳化法和碳二亚胺法成功制备出PPr C纳米粒,该纳米粒呈规则球形,大小均一,分散性好,成功装载PFH和rt PA,为后续超声成像以及血栓治疗奠定基础。第二部分低强度聚焦超声触发载药相变纳米粒溶栓的体外显像及溶栓评价目的:验证此载药相变纳米粒体外超声显像能力以及体外溶栓效果评价。方法:在低强度聚焦超声（LIFU）辐照下,用光声成像仪采集PPr C和Pr C纳米粒在不同时间点的超声（US）图像,同时通过光学显微镜观察PPr C纳米粒相变变化过程。配置浓度梯度为0.196,0.391,0.781,1.563,3.125,6.25,12.5 mg/m L的荧光标记的PPr C纳米粒,采用小动物活体成像仪采集近红外荧光（FL）显像的数据。用酶标仪检测不同处理组别的rt PA体外释放能力,并用热成像仪测量PPr C纳米粒在LIFU辐照下的温度变化趋势。将荧光染料标记的纳米粒与制备好的血块共孵育,在不同的时间点用小动物活体成像仪采集荧光图像。在静态条件下,用制备好的血块与各组别纳米粒共孵育,记录处理前后血块重量,计算溶栓率。在动态条件下,模拟生理条件下血流速度,利用微流控模型观察体外溶栓情况。结果:体外超声显像显示PPr C纳米粒在LIFU辐照下成像效果良好且优于Pr C纳米粒。纳米粒从纳米膨胀到微米级别,随后体积变小。荧光标记的纳米粒随着浓度的升高,纳米粒荧光强度不断增强,呈现明显的浓度依赖性。FITC标记的rt PA的PPr C纳米粒（FPPr C纳米粒）在LIFU辐照下2 h的释放率为（77.75±0.011）%,较其余三组均高。LIFU辐照PPr C纳米粒温度仅升高不到6℃。荧光标记的PPr C纳米粒与血块共孵育,随着时间的延长,血块荧光强度不断升高。在静态条件下,PPr C组溶栓率为51.57%,显著高于其他组别。在动态条件下,PPr C组溶栓率仍显著高于其他组别。结论:这种载药相变纳米粒具有超声显像能力和荧光成像能力,并且在LIFU辐照下,能促进rt PA的释放,且温度不会上升过高。另外,这种纳米粒有良好的体外靶向性能,无论在静态还是在动态条件下溶栓效果均高于其他组别,有较好的体外溶栓能力。第三部分低强度聚焦超声触发载药相变纳米粒溶栓的体内显像、溶栓及安全性评价目的:在体内验证PPr C NPs的靶向能力和超声显像能力,并评价溶栓效果,同时,观察纳米粒生物分布特征和生物安全性。方法:建立大鼠颈静脉血栓模型,通过鼠尾静脉分别注射PPr C纳米粒（靶向纳米粒）和PPr纳米粒（非靶向纳米粒）,用小动物活体成像仪采集大鼠血栓一侧颈静脉区域的荧光图像。在LIFU辐照下,用光声成像仪采集纳米粒注射前后的超声图像。将造好血栓模型的大鼠经过不同方式处理后,切除血管,通过病理切片观察溶栓情况。将PPr C纳米粒通过鼠尾静脉注射到大鼠体内,在不同的时间点取出主要器官（心、肝、脾、肺、肾）用活体成像仪采集荧光图像。通过大鼠血液生化检测评价纳米粒生物安全性。通过大鼠尾巴止血时间判断纳米粒在体内的出血风险性。结果:活体荧光结果显示靶向纳米粒在90分钟时的大鼠血栓一侧颈静脉达到峰值,随后纳米粒浓度有所下降,而非靶向纳米粒在120分钟的观察期内在大鼠血栓一侧颈静脉荧光强度略有升高,趋势较靶向组不明显。超声显像结果显示PPr C纳米粒在注射后,在LIFU辐照下,超声信号显著增强。病理切片结果显示PPr C组在大鼠体内溶栓效果高于其他组别。通过活体成像仪采集荧光图像,发现PPr C纳米粒主要分布在肝脏和脾脏,并且各个主要器官的荧光强度随时间延长而降低。安全性结果显示PPr C纳米粒有良好的生物安全性。大鼠尾巴止血时间显示各纳米粒组（PPr C、PPC、Pr C、PPr组

关键词： PLGA 三步乳化法碳二亚胺法纳米粒相变超声溶栓释药活体荧光生物安全性

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碳二亚胺法制备阿莫西林人工抗原及其鉴定

河南农业科学 2012年第3期41卷 142-145页

作者：刘庆堂王磊职爱民滕蔓胡骁飞孙亚宁宋春美王寅彪张改平河南省农业科学院农业部动物免疫学重点实验室/河南省动物免疫学重点实验室河南郑州450002 河南科技大学食品与生物工程学院河南洛阳471003 江南大学食品学院江苏无锡214122

合成、鉴定了阿莫西林(amoxicillin,AMO)人工抗原,并通过动物免疫法生产了亲和力高、特异性好的鼠源AMO多克隆抗血清。采用碳二亚胺(EDC)法将AMO分别与载体蛋白BSA和OVA偶联,合成完全免疫抗原AMO-BSA和检测抗原AMO-OVA,经紫外分光光度法... 详细信息

合成、鉴定了阿莫西林(amoxicillin,AMO)人工抗原,并通过动物免疫法生产了亲和力高、特异性好的鼠源AMO多克隆抗血清。采用碳二亚胺(EDC)法将AMO分别与载体蛋白BSA和OVA偶联,合成完全免疫抗原AMO-BSA和检测抗原AMO-OVA,经紫外分光光度法和SDS-PAGE以及动物免疫进行鉴定。结果表明,偶联后的紫外吸收峰与BSA和AMO相比都发生了一定的位移,AMO-BSA在276nm处出现最大吸收峰,BSA的泳动速度大于AMO-BSA。免疫后获得的3只小鼠多抗血清,通过间接竞争ELISA测定,效价可达1×10-4以上,1号小鼠半数抑制浓度(IC50)为573.75ng/mL,敏感性较好。AMO完全人工抗原的合成以及鼠源多克隆抗体血清的制备,为AMO单克隆抗体的制备奠定了基础。

关键词：阿莫西林人工抗原合成多克隆抗体碳二亚胺法

雷洛昔芬抗体的制备及ELISA方法的初步建立

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现代食品科技 2018年第5期34卷 198-203页

作者：童雅琪张羽伍金娥常超武汉轻工大学食品科学与工程学院湖北武汉430023 武汉轻工大学教育部大宗粮油精深加工省部共建重点实验室湖北省农产品加工与转化重点实验室湖北武汉430023

本文主要研究了雷洛昔芬抗体的制备和酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)方法的初步建立。实验中采用丁二酸酐对雷洛昔芬进行衍生,合成了雷洛昔芬半抗原。采用碳二亚胺法,将雷洛昔芬半抗原与牛血清白蛋白(BSA... 详细信息

本文主要研究了雷洛昔芬抗体的制备和酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)方法的初步建立。实验中采用丁二酸酐对雷洛昔芬进行衍生,合成了雷洛昔芬半抗原。采用碳二亚胺法,将雷洛昔芬半抗原与牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联合成免疫原和包被抗原,并通过紫外光谱进行鉴定,结果显示雷洛昔芬与载体蛋白偶联成功。免疫大白兔制备了雷洛昔芬抗体,抗体效价达1.28×10~5,半数抑制浓度(half inhibit concentration,IC50)15.4μg/L,与其他类似抗雌激素药物没有交叉反应,说明所制备的抗体特异性好。通过优化抗原抗体反应浓度初步建立了雷洛昔芬ELISA方法,结果显示最佳抗原浓度为300μg/L,最佳抗体工作浓度为1:1.0×10~5,标准曲线在0.4~102.4μg/L范围内线性关系好,R^2=0.9853,最低检测能力0.4μg/L。本研究为进一步开发雷洛昔芬快速检测试剂盒提供了技术参考。

关键词：雷洛昔芬碳二亚胺法人工抗原 ELISA

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庆大霉素人工抗原及多克隆抗体的制备与鉴定

现代食品科技 2014年第6期30卷 152-157,256页

作者：许耀心龚云飞陈宗伦奚茜戴明雁吴莹莹刘啊敏张明洲中国计量学院生命科学学院浙江省生物计量与检验检疫重点实验室浙江杭州310018 杭州迪恩科技有限公司浙江杭州310013

为研究建立庆大霉素的免疫分析技术，合成庆大霉素人工抗原：采用碳二亚胺法将庆大霉素（gentamicin，GM）偶联到牛血清白蛋白（BSA）和鸡卵清蛋白（OVA）上，分别合成免疫原GM-BSA和包被原GM-OVA。通过紫外扫描和SDS-PAGE垂直电泳鉴定... 详细信息

为研究建立庆大霉素的免疫分析技术，合成庆大霉素人工抗原：采用碳二亚胺法将庆大霉素（gentamicin，GM）偶联到牛血清白蛋白（BSA）和鸡卵清蛋白（OVA）上，分别合成免疫原GM-BSA和包被原GM-OVA。通过紫外扫描和SDS-PAGE垂直电泳鉴定证明人工抗原偶联成功。以GM．BSA为免疫原，采用新的动物免疫方案免疫新西兰大白兔，获得抗庆大霉素抗血清。在本次免疫新方案中，在动物的生命周期内获得了多于普通免疫的血清量，在多抗血清的制备上是一次抗体工程上的尝试。通过间接酶联免疫对抗血清效价和灵敏度进行跟踪检测，结果表明抗血清效价在九免后稳定在1：20000左右，IC50则稳定在3ng／mL左右。并在八免血清基础上建立了GM间接竞争ELISA法。结果表明，庆大霉素浓度在0．3-243ng／mL，方法的线性回归方程为y=-0．10091nx＋0．6093和R2=0．9845，方法的检测灵敏度IC50=2．954ng／mL，最低检测限IC10=0．056ng／mL。该研究结果为多抗血清制备在量上的突破提供了思路，同时为研制庆大霉素试剂盒提供了良好的基础。

关键词：庆大霉素人工抗原碳二亚胺法多克隆抗体

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苦参碱纳米粒及其麦胚凝集素修饰产物的制备

中成药 2017年第1期39卷 55-60页

作者：段晓颖贾庆涵刘丽娜程远方河南中医药大学第一附属医院国家中医药管理局中药制剂三级实验室河南郑州450000 河南中医药大学河南郑州450000 河南省滑县人民医院河南安阳456400 河南省肿瘤医院河南郑州450000

目的制备苦参碱纳米粒及其麦胚凝集素修饰产物。方法复乳化-溶剂挥发法制备苦参碱纳米粒,以聚乳酸-羟基乙酸共聚物与苦参碱比例、转速和聚乙烯醇浓度为影响因素,粒径、电位、包封率和载药量为评价指标,通过星点设计优化工艺。碳二亚胺... 详细信息

目的制备苦参碱纳米粒及其麦胚凝集素修饰产物。方法复乳化-溶剂挥发法制备苦参碱纳米粒,以聚乳酸-羟基乙酸共聚物与苦参碱比例、转速和聚乙烯醇浓度为影响因素,粒径、电位、包封率和载药量为评价指标,通过星点设计优化工艺。碳二亚胺法制备麦胚凝集素修饰苦参碱纳米粒,以碳二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺比例、麦胚凝集素加入量和孵化时间为影响因素,粒径、电位和修饰率为评价指标,通过均匀设计优化工艺。结果苦参碱纳米粒的最佳条件为聚乳酸-羟基乙酸共聚物与苦参碱比例0.594∶1,转速815 r/min,聚乙烯醇浓度为0.46%,平均粒径、电位、包封率和载药量分别为112.04 nm、-15.38 m V、90.05%和27.14%。其麦胚凝集素修饰产物的最佳条件为碳二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺比例2.8∶0.12,麦胚凝集素加入量3 mg,孵化时间14 h,平均粒径、电位和修饰率分别为474.7 nm、-5.2 m V和69.51%。结论该制备工艺可靠,所得苦参碱纳米粒及其麦胚凝集素修饰产物性质稳定。

关键词：苦参碱纳米粒麦胚凝集素复乳化-溶剂挥发法碳二亚胺法星点设计均匀设计

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微囊藻毒素人工完全抗原制备与鉴定

黑龙江畜牧兽医 2017年第5期 1-4页

作者：高阳林超郭一平王菡潘悦聂红霞任洪林胡盼李岩松周玉柳曾善卢士英吉林大学人兽共患病研究所/人兽共患病教育部重点实验室长春130062 大连众信检测技术有限公司辽宁大连116045

为了研究微囊藻毒素-LR(MC-LR)的免疫学检测方法,试验制备了MC-LR人工完全抗原,采用水溶性碳二亚胺法将微囊藻毒素的羧基与牛血清白蛋白(BSA)的氨基偶联,同时利用琼脂糖凝胶电泳、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、紫外扫描分析及ELISA等技术... 详细信息

为了研究微囊藻毒素-LR(MC-LR)的免疫学检测方法,试验制备了MC-LR人工完全抗原,采用水溶性碳二亚胺法将微囊藻毒素的羧基与牛血清白蛋白(BSA)的氨基偶联,同时利用琼脂糖凝胶电泳、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、紫外扫描分析及ELISA等技术对偶联结果进行鉴定与分析。结果表明:微囊藻毒素的羧基与BSA的氨基偶联成功。说明人工完全抗原制备成功,可用于MCLR的免疫学检测。

关键词：微囊藻毒素(MCs) 碳二亚胺法偶联人工完全抗原免疫学检测

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大黄酸兔源多克隆抗血清的制备与鉴定

中国中医药信息杂志 2018年第5期25卷 41-45页

作者：王咏枝屈会化邢洪霞张越成金俊熊威罗娟赵琰孔慧王庆国北京中医药大学中药学院北京100029 北京中医药大学中医药研究院北京100029 曲阜市中医院山东曲阜273100 北京中医药大学中医学院北京100029

目的合成大黄酸人工抗原,制备敏感性高、特异性强的大黄酸兔源多克隆抗血清。方法采用碳二亚胺法制备大黄酸人工抗原,将大黄酸分别与牛血清白蛋白和卵清蛋白相偶联。用紫外扫描法鉴定大黄酸人工抗原是否偶联成功,免疫新西兰兔,制备多抗... 详细信息

目的合成大黄酸人工抗原,制备敏感性高、特异性强的大黄酸兔源多克隆抗血清。方法采用碳二亚胺法制备大黄酸人工抗原,将大黄酸分别与牛血清白蛋白和卵清蛋白相偶联。用紫外扫描法鉴定大黄酸人工抗原是否偶联成功,免疫新西兰兔,制备多抗血清,通过间接竞争ELISA测定抗血清效价,通过间接竞争ELISA鉴定抗血清的敏感性和特异性,并分别用间接竞争ELISA和HPLC检测大黄中大黄酸的含量。结果 2只新西兰兔产生的多抗血清效价在1∶64 000以上,其中,2号兔多抗血清敏感性最好,半数抑制浓度为0.09 ng/mL,且具有良好的特异性。兔抗血清测得大黄中大黄酸含量为(0.026±0.001)%,HPLC测得大黄中大黄酸含量为(0.027±0.000)%。结论本研究制备了敏感性高、特异性强的大黄酸兔源多克隆抗体血清,为建立大黄酸免疫亲和色谱分析技术和快速检测方法奠定了基础。

关键词：大黄酸人工抗原碳二亚胺法兔源多抗血清酶联免疫分析