低强度聚焦超声触发载药相变纳米粒溶栓的体内外实验研究

作     者：胡柳 

作者单位：重庆医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：郭大静

授予年度：2022年

学科分类：1006[医学-中西医结合] 10[医学] 100602[医学-中西医结合临床] 

主      题：PLGA 三步乳化法 碳二亚胺法 纳米粒 相变 超声 溶栓 释药 活体荧光 生物安全性 

摘      要：第一部分载药相变型纳米粒的制备及理化性质检测目的:制备一种靶向纤维蛋白的载药相变型纳米粒,并检测其理化性质。方法:采用三步乳化法和碳二亚胺法制备以聚乳酸羟基乙酸（PLGA）为载体,包含重组组织型纤溶酶原激活剂（rt PA）和全氟己烷（PFH）,并连接CREKA多肽的纳米粒（PLGA-PFH-rt PA-CREKA nanoparticles,PPr C NPs）,并使用透射电子显微镜观察PPr C NPs的形貌结构,动态光散射法检测纳米粒的粒径、zeta电位,聚合物分散指数（PDI）以及稳定性。傅里叶红外验证CREKA多肽的氨基和PLGA的羧基脱水缩合形成的酰胺键的形成。流式细胞术半定量分析CREKA携带的数量。结果:成功制备PLGA-PFH-rt PA-CREKA纳米粒,透射电镜显示纳米粒均匀,呈球形,且无聚集现象。激光粒径仪显示纳米粒粒径为209.09±3.01 nm,电位为-6.37±0.18 m V,多分散系数为0.07±0.05,傅里叶红外结果显示PLGA表面的羧基端和CREKA的氨基端发生脱水缩合表明酰胺键的成功连接。流式细胞术显示CREKA的携带率为83.45%。结论:通过三步乳化法和碳二亚胺法成功制备出PPr C纳米粒,该纳米粒呈规则球形,大小均一,分散性好,成功装载PFH和rt PA,为后续超声成像以及血栓治疗奠定基础。第二部分低强度聚焦超声触发载药相变纳米粒溶栓的体外显像及溶栓评价目的:验证此载药相变纳米粒体外超声显像能力以及体外溶栓效果评价。方法:在低强度聚焦超声（LIFU）辐照下,用光声成像仪采集PPr C和Pr C纳米粒在不同时间点的超声（US）图像,同时通过光学显微镜观察PPr C纳米粒相变变化过程。配置浓度梯度为0.196,0.391,0.781,1.563,3.125,6.25,12.5 mg/m L的荧光标记的PPr C纳米粒,采用小动物活体成像仪采集近红外荧光（FL）显像的数据。用酶标仪检测不同处理组别的rt PA体外释放能力,并用热成像仪测量PPr C纳米粒在LIFU辐照下的温度变化趋势。将荧光染料标记的纳米粒与制备好的血块共孵育,在不同的时间点用小动物活体成像仪采集荧光图像。在静态条件下,用制备好的血块与各组别纳米粒共孵育,记录处理前后血块重量,计算溶栓率。在动态条件下,模拟生理条件下血流速度,利用微流控模型观察体外溶栓情况。结果:体外超声显像显示PPr C纳米粒在LIFU辐照下成像效果良好且优于Pr C纳米粒。纳米粒从纳米膨胀到微米级别,随后体积变小。荧光标记的纳米粒随着浓度的升高,纳米粒荧光强度不断增强,呈现明显的浓度依赖性。FITC标记的rt PA的PPr C纳米粒（FPPr C纳米粒）在LIFU辐照下2 h的释放率为（77.75±0.011）%,较其余三组均高。LIFU辐照PPr C纳米粒温度仅升高不到6℃。荧光标记的PPr C纳米粒与血块共孵育,随着时间的延长,血块荧光强度不断升高。在静态条件下,PPr C组溶栓率为51.57%,显著高于其他组别。在动态条件下,PPr C组溶栓率仍显著高于其他组别。结论:这种载药相变纳米粒具有超声显像能力和荧光成像能力,并且在LIFU辐照下,能促进rt PA的释放,且温度不会上升过高。另外,这种纳米粒有良好的体外靶向性能,无论在静态还是在动态条件下溶栓效果均高于其他组别,有较好的体外溶栓能力。第三部分低强度聚焦超声触发载药相变纳米粒溶栓的体内显像、溶栓及安全性评价目的:在体内验证PPr C NPs的靶向能力和超声显像能力,并评价溶栓效果,同时,观察纳米粒生物分布特征和生物安全性。方法:建立大鼠颈静脉血栓模型,通过鼠尾静脉分别注射PPr C纳米粒（靶向纳米粒）和PPr纳米粒（非靶向纳米粒）,用小动物活体成像仪采集大鼠血栓一侧颈静脉区域的荧光图像。在LIFU辐照下,用光声成像仪采集纳米粒注射前后的超声图像。将造好血栓模型的大鼠经过不同方式处理后,切除血管,通过病理切片观察溶栓情况。将PPr C纳米粒通过鼠尾静脉注射到大鼠体内,在不同的时间点取出主要器官（心、肝、脾、肺、肾）用活体成像仪采集荧光图像。通过大鼠血液生化检测评价纳米粒生物安全性。通过大鼠尾巴止血时间判断纳米粒在体内的出血风险性。结果:活体荧光结果显示靶向纳米粒在90分钟时的大鼠血栓一侧颈静脉达到峰值,随后纳米粒浓度有所下降,而非靶向纳米粒在120分钟的观察期内在大鼠血栓一侧颈静脉荧光强度略有升高,趋势较靶向组不明显。超声显像结果显示PPr C纳米粒在注射后,在LIFU辐照下,超声信号显著增强。病理切片结果显示PPr C组在大鼠体内溶栓效果高于其他组别。通过活体成像仪采集荧光图像,发现PPr C纳米粒主要分布在肝脏和脾脏,并且各个主要器官的荧光强度随时间延长而降低。安全性结果显示PPr C纳米粒有良好的生物安全性。大鼠尾巴止血时间显示各纳米粒组（PPr C、PPC、Pr C、PPr组）止血时间显著低于rt PA处理组。结论:PPr C纳米粒在大鼠体内具备超声显像能力且有良好的靶向性,并在90分钟浓度达到峰值。PPr C纳米粒在体内溶栓效果较好,主要分布在肝脏和脾脏,能在体内正常代谢,有良好的生物安全性,且出血风险较常规溶栓药物处理组低。