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熊胆粉对不同时期SD大鼠肝癌的作用及机制的初步探讨

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熊胆粉对不同时期SD大鼠肝癌的作用及机制的初步探讨

作者：张梅西南大学

学位级别：硕士

肝癌发病病因复杂多样,是人类身体健康和生命安全的重大威胁之一。尽管在早期诊断和治疗肝癌方面已有一些进展,但是肝癌的死亡率还是居高不下。熊胆粉（Bear bile power,BBP）,药理作用丰富,药效显著,是卫生部批准的天然中药。但BBP的... 详细信息

肝癌发病病因复杂多样,是人类身体健康和生命安全的重大威胁之一。尽管在早期诊断和治疗肝癌方面已有一些进展,但是肝癌的死亡率还是居高不下。熊胆粉（Bear bile power,BBP）,药理作用丰富,药效显著,是卫生部批准的天然中药。但BBP的作用机理和体内实验效果有待进一步探讨及确认。为了阐明BBP对SD大鼠肝癌形成不同时期的修饰作用,我们使用两阶段短期致癌方法建立了早期和中晚期肝癌模型,对熊胆粉进行了抗肝癌药效实验。同时,探讨筛选了建立中晚期肝癌模型的有效方法。具体如下:1.熊胆粉对大鼠早期肝癌的作用及机制研究40只SD雄性大鼠随机分4组:DEN单独组、DEN+PBO组、DEN+PBO+BBP-L组和DEN+PBO+BBP-H组。实验开始时所有动物均腹腔注射200 mg/kg DEN,第三周开始除DEN单独组外,其余3组动物均饲喂含0.5%PBO粉末饲料。第三周结束后进行三分之二肝脏部分切除术（PH）。BBP处理组动物第3周开始分别灌胃给药200或400 mg/kg BBP 10周。实验结果BBP-L组的大鼠肝癌癌前生物标记物GST-P阳性病灶的数量和面积显著低于DEN+PBO组。BBP处理组的Ki67阳性细胞率与DEN+PBO组相比也显著降低。此外,BBP处理组的细胞增殖核抗原基因Pcna表达量与DEN+PBO组相比明显降低,而抑制细胞周期相关基因Cdkn1b、p21、Rb1的表达量明显升高。其中BBP-H组基因Ccne1、Cdkn1b有统计学差异。另外,BBP处理组的细胞凋亡相关基因Tp53、Bcl2、Bax、Casp3、Casp8、Casp9的表达量与DEN+PBO组相比有升高趋势。其中BBP-H组的Casp8、Casp9有统计学差异。由此可见,在早期肝癌促进阶段,低剂量BBP可通过抑制细胞增殖活性和激活凋亡信号通路,有效抑制GST-P阳性病灶的发展。同时,这些抑制作用可能通过调控停滞G1/S期相关基因Pcna,Cdkn1b、p21和线粒体凋亡信号通路相关基因Casp8、Casp9的表达来实现。2.SD大鼠中晚期肝癌模型建立方法的筛选本章节对课题组前期利用DEN联合亚硝基吗啉（NMOR）建立的肝癌模型方法进行了比较,筛选了适合中晚期肝癌药效试验的新方法。方案一,200mg/kg DEN联合40ppm NMOR在20周内可以建立有100%变异细胞灶的早期肝癌模型,其存活率为100%。方案二,200mg/kg DEN联合40或80ppm NMOR间断性饮水给药10周饲养17周的方法,可建立35%的动物形成中晚期肝肿瘤的动物模型。方案三,200mg/kg DEN联合0.8mg/kg NMOR连续灌胃给药17周饲养24周,并加入PH的方法,可建立中晚期肝肿瘤发病率为100%,生存率55%,肺转移率55%的动物模型。由此可见,第三种方案虽然中晚期肝癌形成率较高,但是后期死亡率较高,影响中晚期肝癌形成后BBP的治疗时间。第二种方案,虽然中晚期肝癌形成率比第三种方案低,但是实验周期短、后期生存率较高,可为BBP处理赢得时间,适合于后期中晚期肝癌的药效试验。3.熊胆粉对中晚期肝癌的作用及机制的初步探讨46只SD雄性大鼠随机分3组:Cont组、DEN+NMOR组和DEN+NMOR+BBP-L组。实验开始时DEN+NMOR和DEN+NMOR+BBP-L组动物均腹腔注射200 mg/kg DEN,同时间断性饮水给药40或80ppm NMOR 10周,之后动物停止给药NMOR,DEN+NMOR+BBP-L组动物每天灌胃给200 mg/kg BBP 7周,实验共17周。结果BBP组的体重、肝重量、病理组织学检查结果与DEN+NMOR组相比均没有显著差异。BBP组的GST-P阳性病灶和TUNEL阳性细胞率与DEN+NMOR组相比,也未见统计学差异。但是,BBP组的Ki67阳性细胞率与DEN+NMOR组相比显著降低。然而,细胞周期和细胞凋亡相关基因的表达量在两组之间均无显著差异。这些结果提示BBP虽然对细胞增殖活性有一定的抑制作用,但是对中晚期肝癌的发展没有显著的影响。综上所述,BBP在早期肝癌促进阶段,可以通过抑制细胞增殖抗原Pcna表达量和调控停滞细胞周期基因Cdkn1b、Ccne1和细胞凋亡相关基因caspase3、caspase8、caspase9的表达来抑制早期肝癌癌前病灶的发生发展。但是到了中晚期,虽然可抑制细胞增殖活性,但对肝癌的发展无明显抑制作用。

关键词：熊胆粉肝癌模型细胞增殖活性凋亡

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熊胆粉的药理作用与新剂型研究进展

中国医院药学杂志 2016年第7期36卷 598-602页

作者：王佳婧郑勇凤秦晶李永吉王建新黑龙江中医药大学黑龙江哈尔滨150040 复旦大学药学院上海201203 成都中医药大学四川成都611137

熊胆粉是一味极具药用价值的中药,本文以近年国内外研究熊胆粉的报道为基础,对熊胆粉及其有效成分的药理作用与新剂型研究进展进行综述,为熊胆粉的进一步开发利用提供依据。

关键词：熊胆粉药理作用新剂型

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一种基于近红外光谱技术的熊胆粉鉴别方法

光谱学与光谱分析 2011年第3期31卷 673-676页

作者：李文龙邢丽红薛东升瞿海斌浙江大学药物信息学研究所浙江杭州310058 上海凯宝药业有限公司上海201418

建立了一种基于近红外光谱分析技术的方法,对熊胆粉的真伪进行了鉴别,并对掺伪品中熊胆粉的掺入比例进行了定量分析。采集了四处不同产地的30份熊胆粉样品,六份猪胆粉份样品,以及65份按不同比例混合的熊胆粉与猪胆粉的混合样品的近红外... 详细信息

建立了一种基于近红外光谱分析技术的方法,对熊胆粉的真伪进行了鉴别,并对掺伪品中熊胆粉的掺入比例进行了定量分析。采集了四处不同产地的30份熊胆粉样品,六份猪胆粉份样品,以及65份按不同比例混合的熊胆粉与猪胆粉的混合样品的近红外光谱,对所采集的样品光谱进行主成分分析,观察到熊胆及其伪品和掺伪品之间存在明显的界限,不同产地的熊胆粉之间也存在着一定的差别。同时利用偏最小二乘方法对熊胆粉,猪胆粉,及二者的混合物建立了判别分析模型和掺伪熊胆粉中熊胆粉的掺入比例的定量校正模型,判别分析模型预测的准确率为95%,定量分析模型的预测集决定系数为0.975 9,预测均方差为4.25%,预测效果满意。研究结果有助于实现熊胆粉的快速、无损鉴别,并为其他贵重药材的质量鉴定提供了借鉴。

关键词：熊胆粉近红外真伪鉴别产地鉴别主成分分析偏最小二乘

熊胆粉的安全性及预防治疗肝癌的作用和机制研究

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熊胆粉的安全性及预防治疗肝癌的作用和机制研究

作者：洪泽宣西南大学

学位级别：硕士

肝癌是全球第五大常见癌症和主要的癌症死亡原因之一。我国宠物行业也面临相同的挑战,伴随着饲养条件和医疗条件的进步,宠物的寿命不断增加,肿瘤性疾病日益增多严重威胁宠物的生命健康。熊胆粉(Bear bile powder,BBP)是动物来源的天然药... 详细信息

肝癌是全球第五大常见癌症和主要的癌症死亡原因之一。我国宠物行业也面临相同的挑战,伴随着饲养条件和医疗条件的进步,宠物的寿命不断增加,肿瘤性疾病日益增多严重威胁宠物的生命健康。熊胆粉(Bear bile powder,BBP)是动物来源的天然药,属卫生部批准的中药。研究表明熊胆粉及主要成分对人肝癌细胞具有抑制增殖、促进凋亡和阻滞细胞周期的作用。近期研究还发现BBP对DNA的损伤有保护作用。然而,它们的抗癌机制仍然是一个谜。传统中药有毒副作用小,药效缓慢的特点。习近平总书记在2019年对中医药工作提出重要指示“充分发挥中医药防病治病的独特优势和作用,为建设健康中国、实现中华民族伟大复兴的中国梦贡献力量”。因此,为了确认BBP的预防治疗作用并解析它的分子机制,首先评价了长期食用BBP的安全性,其次验证了持续低剂量处理BBP(保健式给药)对肝癌的预防治疗效果,并初步分析解明了其作用机理。最后,确认了BBP对DNA损伤的保护作用。为BBP临床应用及抗癌中药的开发利用提供科学依据。具体实验如下:1.熊胆粉连续灌胃SD大鼠90天的亚慢性毒性试验。对SD大鼠连续灌胃熊胆粉90天,确认长期食用熊胆粉的安全性。6周龄的SPF级SD大鼠60只雌雄各半,按体重随机分为对照组(Control)、BBP低剂量组(BBP-L)和BBP高剂量组(BBP-H)3个组,每组雌雄各10只,分别灌胃0,40或200 mg/kg BBP,连续灌胃给药90天。实验结束后对所有生存动物进行深度麻醉后腹主动脉采血,检测血液学和血清生化指标。同时进行大体解剖,采集肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、心脏、胃、肠道、脑、睾丸(♂)或卵巢(♀)等器官称重,计算各器官的脏体系数,并进行病理组织学检查。试验期间,BBP组的体重增长率、摄食量、摄水量与对照组相比,均无显著差异(P>0.05),也未见其他临床症状。脏体系数的统计结果显示,BBP-H组雌性大鼠卵巢的绝对和相对重量显著低于对照组(P熊胆粉前期处理对肝癌的预防治疗效果。为了确认低剂量BBP前期处理对肝癌的预防治疗效果,本次实验利用遗传毒性致癌物N-二乙基亚硝胺(N-diethylnitrosamine,DEN)和N-亚硝基吗啉(N-nitrosomorpholine,NMOR)建立了两阶段致癌模型,进行了BBP的预防治疗肝癌药效实验。45只6周龄的SPF级SD雄性大鼠随机分为:Control组、DEN+NMOR组和DEN+NMOR+BBP组。首先给DEN+NMOR+BBP组灌胃给药10 mg/kg熊胆粉15周,DEN+NMOR和DEN+NMOR+BBP组动物在13周开始时腹腔注射200 mg/kg DEN一次,并在第15周开始饮水给药80ppm的NMOR一直到25周结束。最后对所有生存动物进行深度吸入麻醉后,腹主动脉放血处死,并大体解剖取出肝脏和肺脏进行称重。结果,第13周开始注射DEN和饮水给药NMOR的大鼠体重增长受到了抑制。但是,DEN+NMOR组和DEN+NMOR+BBP组之间体重、肝和肺的相对及绝对重量、生存率均没有统计学差异。病理组织学检查结果,DEN+NMOR组和DEN+NMOR+BBP组的肝癌发生率分别为19%和7%、肝腺瘤发生率分别为31%和33%,均无统计学差异。免疫组织学检查结果,DEN+NMOR+BBP组的细胞增殖活性生物标记物Ki67阳性细胞率显著低于DEN+NMOR组(P<0.01)。DEN+NMOR+BBP组的大鼠肝癌癌前病灶生物标记物胎盘型谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase placental form,GST-P)阳性病灶的数量和面积与DEN+NMOR组相比,有减少的趋势。RT-qPCR结果显示BBP处理显著增加凋亡相关基因Casp

关键词： SD大鼠熊胆粉安全性评价肝癌细胞凋亡 JWA

熊胆粉及其胆汁酸成分抗脂多糖诱导的小胶质细胞炎症作用及机制研究

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熊胆粉及其胆汁酸成分抗脂多糖诱导的小胶质细胞炎症作用及机制研...

作者：朱晗上海中医药大学

学位级别：硕士

目的:本研究主要通过脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的小胶质细胞炎症模型,评价熊胆粉(bear bile powder,BBP)及其胆汁酸成分猪去氧胆酸(hyodeoxycholic acid,HDCA)和鹅去氧胆酸(chenodeoxycholic acid,CDCA)的抗炎作用,并探讨其可能的发生机制,以期为其临床用于炎症相关神经系统疾病治疗提供理论依据。方法:1.BV2小胶质细胞炎症模型建立、给药及炎症相关指标检测:用200 ng/m L的LPS诱导BV2小胶质细胞,建立神经炎症模型。细胞分为对照组、LPS 200 ng/m L组、BBP 25、50、100μg/m L组/HDCA 25、50、100μmol/L组/CDCA 25、50、100μmol/L组、地塞米松(Dexamethasone,DEX)10μmol/L组。预给药BV2细胞BBP(25、50、100μg/m L)/HDCA(25、50、100μmol/L)/CDCA(25、50、100μmol/L)2h,加入LPS继续培养22 h;CCK-8法检测细胞活力,Greiss法检测NO释放含量;实时定量PCR法(RT-PCR)法检测肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)、白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)m RNA的表达;蛋白免疫印迹法(western blot,WB)法检测环氧合酶2(cyclooxygenase-2,COX2)、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,i NOS)、G蛋白偶联受体(G-protein coupled receptor 5,TGR5)蛋白表达;分别预给药BV2细胞BBP(25、50、100μg/m L)/HDCA(25、50、100μmol/L)/CDCA(25、50、100μmol/L)2 h,加入LPS继续培养1 h,WB法检测核转录因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)、NF-κB抑制蛋白α(inhibitor of NF-κB,IκBα)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B(serine/threonine kinase,AKT)信号通路蛋白表达;分别预给药BV2细胞BBP(25、50、100μg/m L)/HDCA(25、50、100μmol/L)2 h,加入LPS继续培养6h,给药CDCA(25、50、100μmol/L)2 h,加入LPS继续培养1 h,细胞免疫荧光法(immunocytochemistry,ICC)观察NF-κB核移位情况;分别预给药BV2细胞BBP(25、50、100μg/m L)/HDCA(25、50、100μmol/L)2 h,加入LPS继续培养1 h,提取核蛋白检测NF-κB表达;将细胞分为对照组、LPS(200 ng/m L)组、LPS+BBP 100μg/m L组、LPS+BBP 100μg/m L+Triamterene 10μmol/L、Triamterene 10μmol/L组或对照组、LPS(200 ng/m L)组、LPS+HDCA 100μmol/L组、LPS+HDCA 100μmol/L+Triamterene 20μmol/L、Triamterene 20μmol/L组,预给药BV2细胞BBP100μg/m L/HDCA100μmol/L及BBP 100μg/m L+Triamterene 10μmol/L/HDCA 100μmol/L+Triamterene 20μmol/L 2 h,除对照组及Triamterene组外,其余各组给予LPS,继续培养22 h,WB法检测炎症相关蛋白表达水平。2.建立LPS诱导的动物炎症模型:用0.8 mg/kg的LPS腹腔注射小鼠建立神经炎症模型。雄性C57BL/6小鼠随机分为:对照组、LPS组、BBP 100、200、400 mg/kg组/HDCA 25、50、100 mg/kg组、DEX 10 mg/kg组共6组,每组12只。除对照组及模型组灌胃给予0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na),其余各组相应灌胃给药,每天1次,共7天。于最后一次给药0.5 h后,除对照组给予生理盐水外,其余各组腹腔注射LPS,24 h后成模。给药同时记录体重变化,q PCR检测TNF-α、IL-6、IL-1β基因m RNA表达;WB法检测海马及大脑皮层中COX2、i NOS、钙离子结合衔接分子(Ionized calcium binding adapter molecule 1,Iba1)、TGR5蛋白及NF-κB/AKT信号通路相关蛋白表达。结果:1.BBP对LPS诱导的BV2细胞炎症作用及机制研究:BBP可以显著抑制NO的释放;显著下调TNF-α、I

关键词：神经炎症熊胆粉猪去氧胆酸鹅去氧胆酸小胶质细胞 NF-κB

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不同来源引流熊胆粉的化学成分系统分析

中国中药杂志 2018年第11期43卷 2326-2332页

作者：王杰熊爱珍程绒绒杨莉王峥涛刘绍勇上海中医药大学中药研究所中药标准化教育部重点实验室暨上海市复方中药重点实验室上海201203 上海中药标准化研究中心上海201203 上海凯宝药业股份有限公司上海201401

熊胆粉中含有胆汁酸、胆红素、蛋白质、氨基酸、微量元素等多种成分,其中胆汁酸类是熊胆粉中含量最高且研究最多的活性成分,而非胆汁酸类成分目前却鲜有报道。因此,该研究对来源为四川、黑龙江、云南的熊胆粉中各化学成分进行系统的研... 详细信息

熊胆粉中含有胆汁酸、胆红素、蛋白质、氨基酸、微量元素等多种成分,其中胆汁酸类是熊胆粉中含量最高且研究最多的活性成分,而非胆汁酸类成分目前却鲜有报道。因此,该研究对来源为四川、黑龙江、云南的熊胆粉中各化学成分进行系统的研究。通过采用微孔板分光光度计法测定胆红素、蛋白质,利用液相色谱质谱联用技术测定胆汁酸和氨基酸,利用电感耦合等离子体质谱仪测定微量元素。并采用相似度评价软件对不同来源的20批熊胆粉进行系统分析,表明不同来源熊胆粉中胆汁酸类成分相似度高（相似度系数为0.922~0.977）,不存在明显差异。所测样本中牛磺熊去氧胆酸与牛磺鹅去氧胆酸是熊胆粉中含量最高的成分,为41%~59%,均符合现行卫生部质量标准。二者总含量在来源为黑龙江的熊胆粉中最高,对不同来源的熊胆粉有分类意义。此外,不同来源熊胆粉中胆红素、蛋白质、氨基酸、微量元素含量也存在着一定的差异。该研究发现不同来源熊胆粉主要化学成分较为相似,但胆汁酸、胆红素、蛋白质、氨基酸、微量元素对不同来源的样本有分类意义,该研究为市售熊胆粉的质量评价和控制提供了更加全面科学的依据。

关键词：熊胆粉胆汁酸氨基酸微量元素胆红素蛋白质

熊胆粉胆酸组的定量表征及其对大鼠胆酸组的调节作用

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熊胆粉胆酸组的定量表征及其对大鼠胆酸组的调节作用

作者：曹妍北京中医药大学

学位级别：硕士

熊胆为熊科动物黑熊或棕熊的干燥胆囊,始载于《新修本草》,是临床常用的传统名贵药材。其性寒味苦,具有“封脉窍、止腐、生肌、明目”之功效。现代临床研究表明熊胆中所含的牛磺熊去氧胆酸、熊去氧胆酸、鹅去氧胆酸等几十种胆汁酸成分... 详细信息

熊胆为熊科动物黑熊或棕熊的干燥胆囊,始载于《新修本草》,是临床常用的传统名贵药材。其性寒味苦,具有“封脉窍、止腐、生肌、明目”之功效。现代临床研究表明熊胆中所含的牛磺熊去氧胆酸、熊去氧胆酸、鹅去氧胆酸等几十种胆汁酸成分及胆固醇、氨基酸等对治疗肝胆疾病及因肝胆失调引起的相关疾病具有显著疗效。因此,阐明熊胆粉化学成分组及其作用机制对临床合理用药具有重要意义。课题组前期已通过构建反相色谱-亲水作用色谱直接耦联系统-定制多反应监测模式（RPLC-HILIC-tailored MRM）实现了熊胆粉及其他十余种胆类中药化学成分组的深入比较分析。这些胆类中药中主要含有氨基酸、胆汁酸、花生四烯酸等成分。并且,熊胆粉与其他胆类中药存在显著差异,不同厂家的熊胆粉成分含量也存在不同,其中胆酸类成分是主要差异化学成分。本研究在课题组前期研究基础上,针对胆酸类成分,首先利用1H-NMR技术初步阐明熊胆粉及其他胆类中药化学成分组成,结果表明熊胆粉与其它胆类中药均主要含有胆酸类成分,差异成分也为该类成分。进一步,利用LC-MS建立了胆酸类成分全面定量表征分析方法,对熊胆粉及其他胆类中药的化学成分组进行了深入的比较分析,并结合药物代谢组学方法对熊胆粉给药后对大鼠胆酸组的调节作用进行了研究。具体研究内容和结果如下:1.文献综述:通过查阅国内外文献,系统综述了熊胆粉的化学成分、体内过程及其在利胆保肝方面的研究进展。现有研究表明熊胆粉中化学成分类型丰富,其主要成分为胆酸类成分,还含有胆色素、黏蛋白、氨基酸、少量脂类和微量元素等。熊胆粉及其主要成分在利胆保肝方面疗效显著。然而,由于熊胆粉的药效物质与体内内源性成分相同或相近,给熊胆粉的药效物质和作用机制的深入阐明带来了巨大困难,所以亟需系统地研究熊胆粉各化学成分的体内代谢过程,为熊胆粉临床用药提供理论依据。2.基于LC-MS平台的胆酸组检测方法的构建:首先,对已有的胆酸类成分对照品进行在线参数优化,获得相应的最佳碰撞能（OCE）和半数响应碰撞能（CE50）,找到胆酸类成分同分异构体的质谱表现差异,并结合量子化学计算总结碰撞能与化学结构的定量相关关系。将十余种胆类中药提取物和大鼠的血浆、胆汁、尿液粪便等生物样品混合,构建涵括绝大多数天然胆酸类化合物的模式样品（UMS）;然后利用IT-TOF-MS提供的多级质谱数据结合Qtrap-MS的多种扫描模式,如预测多反应监测模式（pMRM）、母离子扫描（Prec）、中性丢失扫描（NL）、增强质谱扫描（EMS）、增强子离子扫描（E PI）等模式对UMS样品进行深入的定性分析,最后通过对照品匹配、数据库和文献比对对UMS样品中的胆酸类成分定性分析。从UMS中共鉴定了 120种胆酸类化学成分,其中包括27种游离型胆汁酸、14种甘氨型胆酸、30种牛磺型胆酸、19种胆酸磺酸化产物和30种胆酸葡萄糖醛酸化产物。进一步,利用LC-MS平台建立了 120种胆酸类化合物同步定量分析的方法。为熊胆粉胆酸组的定量表征及对体内胆酸池的动态变化规律研究提供了有效的方法。3.熊胆粉胆酸组定量表征:鉴于NMR具有“无歧视”的优点,可以通过该检测手段快速、全面地获得中药复杂化学体系的定性定量信息。本研究利用1H-NMR技术针对熊胆粉和十余种常见胆类中药中的胆酸类化学成分进行比较分析,从熊胆粉中鉴定出7种胆酸类化学成分,熊胆粉中的牛磺熊去氧胆酸和熊去氧胆酸的含量显著高于其他胆类中药。为了克服NMR图谱中结构类似的化合物信号堆叠严重,微量成分难以鉴定的技术难题,我们进一步利用构建的胆酸组定量表征方法对各胆类中药进行深入分析,从熊胆粉中初步鉴定了 63种胆酸类成分,其中含有20种游离型胆酸、6种甘氨型胆酸、27种牛磺型胆酸和10种胆酸葡萄糖醛酸化产物。利用对照品构建标准曲线,对其中的10种胆酸类化学成分进行了绝对定量分析。然后,利用构建的UMS样品梯度稀释,构建标准曲线,实现了对所检测到的胆酸类成分进行全面的定量分析。通过多元统计分析发现,熊胆粉中胆酸类化合物的含量与其他胆类中药相比存在显著差异,差异性成分主要包括牛磺熊去氧胆酸,牛磺鹅去氧胆酸及其同分异构体,以及牛磺熊去氧酮酸、牛磺型胆酸的葡萄糖醛酸化产物等。通过NMR和LC-MS技术对熊胆粉中的胆酸类成分深入分析,阐明了熊胆粉中的定量胆酸组,并与其他胆类中药进行了深入的比较分析,确定了差异化学成分,为熊胆粉质量控制和替代资源开发提供参考。4.熊胆粉对大鼠胆酸组的调节作用:利用前期构建的胆酸组定量表征方法分别对熊胆粉及其主要成分熊去氧胆酸、牛磺熊去氧胆酸给药后大鼠血浆中的胆酸池随时间的变化轨迹进行研究,以探究熊胆粉对大鼠胆酸组的调节作用。与给药组大鼠相比,空白组大鼠体内胆酸池随时间并没有发生明显变化;与空白组相比,熊胆粉及其主要成分给药能够显著扰动大鼠体内的胆酸池,其中熊胆粉给药对胆酸池的扰动最大,显著强于熊去氧胆酸（UDCA）和牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）对

关键词：胆酸组定量表征 LC-MS TUDCA UDCA 熊胆粉

基于化学成分差异的不同干燥方式熊胆粉镇痛作用研究

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中草药 2021年第18期52卷 5569-5580页

作者：杨俊莉钟林江雷阳邓妍高天赐徐玉玲刘涛张坤成都大学药学院四川成都610106 成都大学食品与生物工程学院四川成都610106 成都柏瑞泰生物科技有限公司四川成都610106 四川省抗病毒中药产业化工程技术研究中心四川成都610106

目的采用超高效液相-三重四极杆-线性离子阱质谱(UPLC-QTRAP-MS)方法鉴定常压及减压干燥熊胆粉的化学成分,明确其差异成分,并以网络药理学理念为指导,探索熊胆粉镇痛作用机制。方法基于UPLC-MS/MS检测平台、数据库以及多元统计分析相结... 详细信息

目的采用超高效液相-三重四极杆-线性离子阱质谱(UPLC-QTRAP-MS)方法鉴定常压及减压干燥熊胆粉的化学成分,明确其差异成分,并以网络药理学理念为指导,探索熊胆粉镇痛作用机制。方法基于UPLC-MS/MS检测平台、数据库以及多元统计分析相结合的手段研究熊胆粉的化学成分差异;借助PharmMapper、Uniprot、GeneCards数据库及文献,获取熊胆粉成分和病毒性肝炎、胆囊炎及冠心病的作用靶点,并采用动物试验对其药效进行验证;对疾病靶标-药物靶标集做拓扑分析获得核心靶标,并进行基因本体(GO)功能和基因与信号通路分析(KEGG)通路富集,通过Cytoscape3.8.2软件构建成分-靶标-通路网络图。结果常压干燥、减压干燥熊胆粉共有成分721个,差异成分8个(L-焦谷氨酸、鸟苷5′-单磷酸水合物、5,6-二氢胸腺嘧啶、7-甲基黄嘌呤、左旋甲状腺素、甲基间酪氨酸、大黄素8-葡萄糖苷、益母草碱),搜索得到差异成分潜在靶点共1605个;检索得到病毒性肝炎靶点7444个、胆囊炎靶点636个、冠心病靶点7563个;熊胆粉对病毒性肝炎、胆囊炎及冠心病的共同靶点有282个,GO功能富集分析得到GO条目759个(P熊胆粉中的鸟苷5′-单磷酸水合物、甲基间酪氨酸、左旋甲状腺素及大黄素8-葡萄糖苷等成分可能通过二氢硫辛酸脱氢酶(dihydrolipoyl dehydrogenase,DLD)、过氧化氢酶(atalase,CATC)及一氧化氮合酶2(nitric oxide synthase 2,NOS2)等靶点,调节代谢通路和癌症通路等信号通路发挥其镇痛作用。药效试验结果表明常压、减压干燥熊胆粉均对热板及醋酸所致小鼠疼痛有抑制作用,且减压组镇痛作用强于常压组,有显著性差异(P熊胆粉化学成分变异,从而导致其镇痛作用差异,初步探索了熊胆粉镇痛作用的机制,建议大生产中采用减压干燥制备熊胆粉,为熊胆粉合理应用提供了一定依据。

关键词：熊胆粉干燥方式差异成分镇痛作用网络药理学超高效液相-三重四极杆-线性离子阱质谱(UPLC-QTRAP-MS) 常压干燥减压干燥 L-焦谷氨酸鸟苷5′-单磷酸水合物 5,6-二氢胸腺嘧啶 7-甲基黄嘌呤左旋甲状腺素甲基间酪氨酸大黄素8-葡萄糖苷益母草碱二氢硫辛酸脱氢酶过氧化氢酶一氧化氮合酶2

熊胆粉对H_2O_2所致的PC12细胞凋亡的保护作用及机制

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中华中医药杂志 2014年第1期29卷 55-59页

作者：富苏范吉平中国中医科学院眼科医院北京100040 中国中医科学院北京100700

目的:探讨熊胆粉对H2O2所致的PC12细胞凋亡的保护作用及机制。方法:PC12细胞常规培养后,首先通过MTT检测细胞存活率的方法进行H2O2损伤模型的摸索和熊胆粉药物浓度的筛选;确定造PC12细胞损伤的H2O2浓度和熊胆粉的安全作用浓度后,将处于... 详细信息

目的:探讨熊胆粉对H2O2所致的PC12细胞凋亡的保护作用及机制。方法:PC12细胞常规培养后,首先通过MTT检测细胞存活率的方法进行H2O2损伤模型的摸索和熊胆粉药物浓度的筛选;确定造PC12细胞损伤的H2O2浓度和熊胆粉的安全作用浓度后,将处于对数生长期的PC12细胞分为对照组、模型组和不同剂量熊胆粉组。用200μmol/L H2O2刺激PC12细胞使其发生凋亡,MTT法检测PC12细胞存活率、Hoechst33342荧光核染色观察细胞凋亡形态学改变、流式细胞仪检测PC12细胞凋亡率、Western blot方法检测与细胞凋亡线粒体途径密切相关的蛋白CytC和Caspase-3表达的变化。结果:200μmol/L H2O2诱导PC12细胞损伤明显,浓度小于等于100μmol/L的熊胆粉浓度对正常PC12细胞的存活率没有抑制作用。与模型组比较,熊胆粉组PC12细胞存活率显著提高(P熊胆粉可抑制H2O2诱导的PC12细胞凋亡,其机制可能与抑制细胞凋亡线粒体途径中凋亡相关蛋白CytC和Caspase-3的表达有关。

关键词： H2O2 PC12细胞细胞凋亡线粒体熊胆粉 CytC Caspase-3