熊胆粉及其胆汁酸成分抗脂多糖诱导的小胶质细胞炎症作用及机制研究

作     者：朱晗 

作者单位：上海中医药大学 

学位级别：硕士

导师姓名：吴晓俊;黄菲

授予年度：2020年

学科分类：1006[医学-中西医结合] 10[医学] 100602[医学-中西医结合临床] 

主      题：神经炎症 熊胆粉 猪去氧胆酸 鹅去氧胆酸 小胶质细胞 NF-κB 

摘      要：目的:本研究主要通过脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的小胶质细胞炎症模型,评价熊胆粉(bear bile powder,BBP)及其胆汁酸成分猪去氧胆酸(hyodeoxycholic acid,HDCA)和鹅去氧胆酸(chenodeoxycholic acid,CDCA)的抗炎作用,并探讨其可能的发生机制,以期为其临床用于炎症相关神经系统疾病治疗提供理论依据。方法:1.BV2小胶质细胞炎症模型建立、给药及炎症相关指标检测:用200 ng/m L的LPS诱导BV2小胶质细胞,建立神经炎症模型。细胞分为对照组、LPS 200 ng/m L组、BBP 25、50、100μg/m L组/HDCA 25、50、100μmol/L组/CDCA 25、50、100μmol/L组、地塞米松(Dexamethasone,DEX)10μmol/L组。预给药BV2细胞BBP(25、50、100μg/m L)/HDCA(25、50、100μmol/L)/CDCA(25、50、100μmol/L)2h,加入LPS继续培养22 h;CCK-8法检测细胞活力,Greiss法检测NO释放含量;实时定量PCR法(RT-PCR)法检测肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)、白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)m RNA的表达;蛋白免疫印迹法(western blot,WB)法检测环氧合酶2(cyclooxygenase-2,COX2)、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,i NOS)、G蛋白偶联受体(G-protein coupled receptor 5,TGR5)蛋白表达;分别预给药BV2细胞BBP(25、50、100μg/m L)/HDCA(25、50、100μmol/L)/CDCA(25、50、100μmol/L)2 h,加入LPS继续培养1 h,WB法检测核转录因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)、NF-κB抑制蛋白α(inhibitor of NF-κB,IκBα)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B(serine/threonine kinase,AKT)信号通路蛋白表达;分别预给药BV2细胞BBP(25、50、100μg/m L)/HDCA(25、50、100μmol/L)2 h,加入LPS继续培养6h,给药CDCA(25、50、100μmol/L)2 h,加入LPS继续培养1 h,细胞免疫荧光法(immunocytochemistry,ICC)观察NF-κB核移位情况;分别预给药BV2细胞BBP(25、50、100μg/m L)/HDCA(25、50、100μmol/L)2 h,加入LPS继续培养1 h,提取核蛋白检测NF-κB表达;将细胞分为对照组、LPS(200 ng/m L)组、LPS+BBP 100μg/m L组、LPS+BBP 100μg/m L+Triamterene 10μmol/L、Triamterene 10μmol/L组或对照组、LPS(200 ng/m L)组、LPS+HDCA 100μmol/L组、LPS+HDCA 100μmol/L+Triamterene 20μmol/L、Triamterene 20μmol/L组,预给药BV2细胞BBP100μg/m L/HDCA100μmol/L及BBP 100μg/m L+Triamterene 10μmol/L/HDCA 100μmol/L+Triamterene 20μmol/L 2 h,除对照组及Triamterene组外,其余各组给予LPS,继续培养22 h,WB法检测炎症相关蛋白表达水平。2.建立LPS诱导的动物炎症模型:用0.8 mg/kg的LPS腹腔注射小鼠建立神经炎症模型。雄性C57BL/6小鼠随机分为:对照组、LPS组、BBP 100、200、400 mg/kg组/HDCA 25、50、100 mg/kg组、DEX 10 mg/kg组共6组,每组12只。除对照组及模型组灌胃给予0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na),其余各组相应灌胃给药,每天1次,共7天。于最后一次给药0.5 h后,除对照组给予生理盐水外,其余各组腹腔注射LPS,24 h后成模。给药同时记录体重变化,q PCR检测TNF-α、IL-6、IL-1β基因m RNA表达;WB法检测海马及大脑皮层中COX2、i NOS、钙离子结合衔接分子(Ionized calcium binding adapter molecule 1,Iba1)、TGR5蛋白及NF-κB/AKT信号通路相关蛋白表达。结果:1.BBP对LPS诱导的BV2细胞炎症作用及机制研究:BBP可以显著抑制NO的释放;显著下调TNF-α、IL-6和IL-1β基因m RNA的表达;减少NF-κB核移位;显著下调i NOS、COX2蛋白表达,显著上调TGR5及下调NF-κB、IκBα及AKT通路蛋白磷酸化表达;给予TGR5抑制剂后,BBP抑制炎症相关蛋白表达的作用显著降低。2.BBP对LPS诱导的炎症模型小鼠作用及机制研究:BBP给药能显著降低小鼠海马中TNF-α、IL-6和IL-1βm RNA的表达;下调i NOS、COX2及Iba1蛋白表达,并上调TGR5蛋白表达,减少NF-κB、IκBα及AKT通路蛋白磷酸化表达。3.HDCA对LPS诱导的BV2细胞炎症作用及机制研究:HDCA可以显著抑制NO的产生;显著下调TNF-α、IL-6和IL-1β基因m RNA的表达;可以减少NF-κB核移位;并显著下调i NOS、COX2蛋白表达,显著上调TGR5的同时显著下调NF-κB、IκBα及AKT通路蛋白磷酸化表达;给予TGR5抑制剂后,HDCA抑制炎症相关蛋白表达的作用显著降低。4.HDCA对LPS诱导的炎症模型小鼠作用及机制研究:HDCA给药后能显著降低小鼠海马中TNF-α、IL-6和IL-1βm RNA含量;下调i NOS、COX2及Iba1蛋白表达,能显著上调TGR5蛋白表达同时显著下调NF-κB、IκBα及AKT通路蛋白磷酸化表达。5.CDCA对LPS诱导的BV2细胞炎症作用及机制研究:CDCA能显著抑制NO的释放;可以显著下调TNF-α、IL-6和IL-1β基因m RNA的表达,上调TGR5基因m RNA的表达;减少NF-κB核移位;显著下调i NOS、COX2蛋白表达,显著增加TGR5同时显著减少NF-κB、IκBα及AKT通路蛋白磷酸化表达。结论:1.BBP具有显著的抗神经炎症作用,可以抑制LPS诱导的小胶质细胞激活,其发生机制与上调TGR5,抑制AKT/IκBα/NF-κB信号通路相关。2.HDCA具有显著的抗神经炎症作用,可以抑制LPS诱导的小胶质细胞激活,其作用机制与上调TGR5,抑制AKT/IκBα/NF-κB信号通路相关。3.CDCA能有效抑制LPS诱导的BV2细胞的激活,其作用机制可能与上调TGR5,抑制AKT/IκBα/NF-κB信号通路相关。