熊胆粉对不同时期SD大鼠肝癌的作用及机制的初步探讨

作     者：张梅 

作者单位：西南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：金美兰

授予年度：2020年

学科分类：1006[医学-中西医结合] 10[医学] 100602[医学-中西医结合临床] 

主      题：熊胆粉 肝癌模型 细胞增殖活性 凋亡 

摘      要：肝癌发病病因复杂多样,是人类身体健康和生命安全的重大威胁之一。尽管在早期诊断和治疗肝癌方面已有一些进展,但是肝癌的死亡率还是居高不下。熊胆粉(Bear bile power,BBP),药理作用丰富,药效显著,是卫生部批准的天然中药。但BBP的作用机理和体内实验效果有待进一步探讨及确认。为了阐明BBP对SD大鼠肝癌形成不同时期的修饰作用,我们使用两阶段短期致癌方法建立了早期和中晚期肝癌模型,对熊胆粉进行了抗肝癌药效实验。同时,探讨筛选了建立中晚期肝癌模型的有效方法。具体如下:1.熊胆粉对大鼠早期肝癌的作用及机制研究40只SD雄性大鼠随机分4组:DEN单独组、DEN+PBO组、DEN+PBO+BBP-L组和DEN+PBO+BBP-H组。实验开始时所有动物均腹腔注射200 mg/kg DEN,第三周开始除DEN单独组外,其余3组动物均饲喂含0.5%PBO粉末饲料。第三周结束后进行三分之二肝脏部分切除术(PH)。BBP处理组动物第3周开始分别灌胃给药200或400 mg/kg BBP 10周。实验结果BBP-L组的大鼠肝癌癌前生物标记物GST-P阳性病灶的数量和面积显著低于DEN+PBO组。BBP处理组的Ki67阳性细胞率与DEN+PBO组相比也显著降低。此外,BBP处理组的细胞增殖核抗原基因Pcna表达量与DEN+PBO组相比明显降低,而抑制细胞周期相关基因Cdkn1b、p21、Rb1的表达量明显升高。其中BBP-H组基因Ccne1、Cdkn1b有统计学差异。另外,BBP处理组的细胞凋亡相关基因Tp53、Bcl2、Bax、Casp3、Casp8、Casp9的表达量与DEN+PBO组相比有升高趋势。其中BBP-H组的Casp8、Casp9有统计学差异。由此可见,在早期肝癌促进阶段,低剂量BBP可通过抑制细胞增殖活性和激活凋亡信号通路,有效抑制GST-P阳性病灶的发展。同时,这些抑制作用可能通过调控停滞G1/S期相关基因Pcna,Cdkn1b、p21和线粒体凋亡信号通路相关基因Casp8、Casp9的表达来实现。2.SD大鼠中晚期肝癌模型建立方法的筛选本章节对课题组前期利用DEN联合亚硝基吗啉(NMOR)建立的肝癌模型方法进行了比较,筛选了适合中晚期肝癌药效试验的新方法。方案一,200mg/kg DEN联合40ppm NMOR在20周内可以建立有100%变异细胞灶的早期肝癌模型,其存活率为100%。方案二,200mg/kg DEN联合40或80ppm NMOR间断性饮水给药10周饲养17周的方法,可建立35%的动物形成中晚期肝肿瘤的动物模型。方案三,200mg/kg DEN联合0.8mg/kg NMOR连续灌胃给药17周饲养24周,并加入PH的方法,可建立中晚期肝肿瘤发病率为100%,生存率55%,肺转移率55%的动物模型。由此可见,第三种方案虽然中晚期肝癌形成率较高,但是后期死亡率较高,影响中晚期肝癌形成后BBP的治疗时间。第二种方案,虽然中晚期肝癌形成率比第三种方案低,但是实验周期短、后期生存率较高,可为BBP处理赢得时间,适合于后期中晚期肝癌的药效试验。3.熊胆粉对中晚期肝癌的作用及机制的初步探讨46只SD雄性大鼠随机分3组:Cont组、DEN+NMOR组和DEN+NMOR+BBP-L组。实验开始时DEN+NMOR和DEN+NMOR+BBP-L组动物均腹腔注射200 mg/kg DEN,同时间断性饮水给药40或80ppm NMOR 10周,之后动物停止给药NMOR,DEN+NMOR+BBP-L组动物每天灌胃给200 mg/kg BBP 7周,实验共17周。结果BBP组的体重、肝重量、病理组织学检查结果与DEN+NMOR组相比均没有显著差异。BBP组的GST-P阳性病灶和TUNEL阳性细胞率与DEN+NMOR组相比,也未见统计学差异。但是,BBP组的Ki67阳性细胞率与DEN+NMOR组相比显著降低。然而,细胞周期和细胞凋亡相关基因的表达量在两组之间均无显著差异。这些结果提示BBP虽然对细胞增殖活性有一定的抑制作用,但是对中晚期肝癌的发展没有显著的影响。综上所述,BBP在早期肝癌促进阶段,可以通过抑制细胞增殖抗原Pcna表达量和调控停滞细胞周期基因Cdkn1b、Ccne1和细胞凋亡相关基因caspase3、caspase8、caspase9的表达来抑制早期肝癌癌前病灶的发生发展。但是到了中晚期,虽然可抑制细胞增殖活性,但对肝癌的发展无明显抑制作用。