熊胆粉胆酸组的定量表征及其对大鼠胆酸组的调节作用

作     者：曹妍 

作者单位：北京中医药大学 

学位级别：硕士

导师姓名：屠鹏飞;宋月林

授予年度：2020年

学科分类：1006[医学-中西医结合] 10[医学] 100602[医学-中西医结合临床] 

主      题：胆酸组 定量表征 LC-MS TUDCA UDCA 熊胆粉 

摘      要：熊胆为熊科动物黑熊或棕熊的干燥胆囊,始载于《新修本草》,是临床常用的传统名贵药材。其性寒味苦,具有“封脉窍、止腐、生肌、明目之功效。现代临床研究表明熊胆中所含的牛磺熊去氧胆酸、熊去氧胆酸、鹅去氧胆酸等几十种胆汁酸成分及胆固醇、氨基酸等对治疗肝胆疾病及因肝胆失调引起的相关疾病具有显著疗效。因此,阐明熊胆粉化学成分组及其作用机制对临床合理用药具有重要意义。课题组前期已通过构建反相色谱-亲水作用色谱直接耦联系统-定制多反应监测模式（RPLC-HILIC-tailored MRM）实现了熊胆粉及其他十余种胆类中药化学成分组的深入比较分析。这些胆类中药中主要含有氨基酸、胆汁酸、花生四烯酸等成分。并且,熊胆粉与其他胆类中药存在显著差异,不同厂家的熊胆粉成分含量也存在不同,其中胆酸类成分是主要差异化学成分。本研究在课题组前期研究基础上,针对胆酸类成分,首先利用1H-NMR技术初步阐明熊胆粉及其他胆类中药化学成分组成,结果表明熊胆粉与其它胆类中药均主要含有胆酸类成分,差异成分也为该类成分。进一步,利用LC-MS建立了胆酸类成分全面定量表征分析方法,对熊胆粉及其他胆类中药的化学成分组进行了深入的比较分析,并结合药物代谢组学方法对熊胆粉给药后对大鼠胆酸组的调节作用进行了研究。具体研究内容和结果如下:1.文献综述:通过查阅国内外文献,系统综述了熊胆粉的化学成分、体内过程及其在利胆保肝方面的研究进展。现有研究表明熊胆粉中化学成分类型丰富,其主要成分为胆酸类成分,还含有胆色素、黏蛋白、氨基酸、少量脂类和微量元素等。熊胆粉及其主要成分在利胆保肝方面疗效显著。然而,由于熊胆粉的药效物质与体内内源性成分相同或相近,给熊胆粉的药效物质和作用机制的深入阐明带来了巨大困难,所以亟需系统地研究熊胆粉各化学成分的体内代谢过程,为熊胆粉临床用药提供理论依据。2.基于LC-MS平台的胆酸组检测方法的构建:首先,对已有的胆酸类成分对照品进行在线参数优化,获得相应的最佳碰撞能（OCE）和半数响应碰撞能（CE50）,找到胆酸类成分同分异构体的质谱表现差异,并结合量子化学计算总结碰撞能与化学结构的定量相关关系。将十余种胆类中药提取物和大鼠的血浆、胆汁、尿液粪便等生物样品混合,构建涵括绝大多数天然胆酸类化合物的模式样品（UMS）;然后利用IT-TOF-MS提供的多级质谱数据结合Qtrap-MS的多种扫描模式,如预测多反应监测模式（pMRM）、母离子扫描（Prec）、中性丢失扫描（NL）、增强质谱扫描（EMS）、增强子离子扫描（E PI）等模式对UMS样品进行深入的定性分析,最后通过对照品匹配、数据库和文献比对对UMS样品中的胆酸类成分定性分析。从UMS中共鉴定了 120种胆酸类化学成分,其中包括27种游离型胆汁酸、14种甘氨型胆酸、30种牛磺型胆酸、19种胆酸磺酸化产物和30种胆酸葡萄糖醛酸化产物。进一步,利用LC-MS平台建立了 120种胆酸类化合物同步定量分析的方法。为熊胆粉胆酸组的定量表征及对体内胆酸池的动态变化规律研究提供了有效的方法。3.熊胆粉胆酸组定量表征:鉴于NMR具有“无歧视的优点,可以通过该检测手段快速、全面地获得中药复杂化学体系的定性定量信息。本研究利用1H-NMR技术针对熊胆粉和十余种常见胆类中药中的胆酸类化学成分进行比较分析,从熊胆粉中鉴定出7种胆酸类化学成分,熊胆粉中的牛磺熊去氧胆酸和熊去氧胆酸的含量显著高于其他胆类中药。为了克服NMR图谱中结构类似的化合物信号堆叠严重,微量成分难以鉴定的技术难题,我们进一步利用构建的胆酸组定量表征方法对各胆类中药进行深入分析,从熊胆粉中初步鉴定了 63种胆酸类成分,其中含有20种游离型胆酸、6种甘氨型胆酸、27种牛磺型胆酸和10种胆酸葡萄糖醛酸化产物。利用对照品构建标准曲线,对其中的10种胆酸类化学成分进行了绝对定量分析。然后,利用构建的UMS样品梯度稀释,构建标准曲线,实现了对所检测到的胆酸类成分进行全面的定量分析。通过多元统计分析发现,熊胆粉中胆酸类化合物的含量与其他胆类中药相比存在显著差异,差异性成分主要包括牛磺熊去氧胆酸,牛磺鹅去氧胆酸及其同分异构体,以及牛磺熊去氧酮酸、牛磺型胆酸的葡萄糖醛酸化产物等。通过NMR和LC-MS技术对熊胆粉中的胆酸类成分深入分析,阐明了熊胆粉中的定量胆酸组,并与其他胆类中药进行了深入的比较分析,确定了差异化学成分,为熊胆粉质量控制和替代资源开发提供参考。4.熊胆粉对大鼠胆酸组的调节作用:利用前期构建的胆酸组定量表征方法分别对熊胆粉及其主要成分熊去氧胆酸、牛磺熊去氧胆酸给药后大鼠血浆中的胆酸池随时间的变化轨迹进行研究,以探究熊胆粉对大鼠胆酸组的调节作用。与给药组大鼠相比,空白组大鼠体内胆酸池随时间并没有发生明显变化;与空白组相比,熊胆粉及其主要成分给药能够显著扰动大鼠体内的胆酸池,其中熊胆粉给药对胆酸池的扰动最大,显著强于熊去氧胆酸（UDCA）和牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）对于大鼠胆酸池的扰动效果,表明熊胆粉对于机体的影响更大。尤其在给药后的8～20h期间,大鼠体内胆酸池扰动最为明显,不仅使胆酸代谢网络下游的胆酸类成分的含量发生明显变化,上游的胆酸类成分含量也显著增加。72 h后,大鼠体内胆酸池基本恢复稳态。通过对大鼠体内胆酸池全面定量分析,阐明熊胆粉及UDCA、TUDCA对大鼠胆酸组的调节作用,并且找到差异性胆酸类化合物,对寻找药物作用靶点和临床应用均具有指导意义。