熊胆粉的安全性及预防治疗肝癌的作用和机制研究

作     者：洪泽宣 

作者单位：西南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：金美兰

授予年度：2021年

学科分类：090603[农学-临床兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：SD大鼠 熊胆粉 安全性评价 肝癌 细胞凋亡 JWA 

摘      要：肝癌是全球第五大常见癌症和主要的癌症死亡原因之一。我国宠物行业也面临相同的挑战,伴随着饲养条件和医疗条件的进步,宠物的寿命不断增加,肿瘤性疾病日益增多严重威胁宠物的生命健康。熊胆粉(Bear bile powder,BBP)是动物来源的天然药,属卫生部批准的中药。研究表明熊胆粉及主要成分对人肝癌细胞具有抑制增殖、促进凋亡和阻滞细胞周期的作用。近期研究还发现BBP对DNA的损伤有保护作用。然而,它们的抗癌机制仍然是一个谜。传统中药有毒副作用小,药效缓慢的特点。习近平总书记在2019年对中医药工作提出重要指示“充分发挥中医药防病治病的独特优势和作用,为建设健康中国、实现中华民族伟大复兴的中国梦贡献力量。因此,为了确认BBP的预防治疗作用并解析它的分子机制,首先评价了长期食用BBP的安全性,其次验证了持续低剂量处理BBP(保健式给药)对肝癌的预防治疗效果,并初步分析解明了其作用机理。最后,确认了BBP对DNA损伤的保护作用。为BBP临床应用及抗癌中药的开发利用提供科学依据。具体实验如下:1.熊胆粉连续灌胃SD大鼠90天的亚慢性毒性试验。对SD大鼠连续灌胃熊胆粉90天,确认长期食用熊胆粉的安全性。6周龄的SPF级SD大鼠60只雌雄各半,按体重随机分为对照组(Control)、BBP低剂量组(BBP-L)和BBP高剂量组(BBP-H)3个组,每组雌雄各10只,分别灌胃0,40或200 mg/kg BBP,连续灌胃给药90天。实验结束后对所有生存动物进行深度麻醉后腹主动脉采血,检测血液学和血清生化指标。同时进行大体解剖,采集肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、心脏、胃、肠道、脑、睾丸(♂)或卵巢(♀)等器官称重,计算各器官的脏体系数,并进行病理组织学检查。试验期间,BBP组的体重增长率、摄食量、摄水量与对照组相比,均无显著差异(P0.05),也未见其他临床症状。脏体系数的统计结果显示,BBP-H组雌性大鼠卵巢的绝对和相对重量显著低于对照组(P0.05或P0.01);此外BBP-H组雌性大鼠肝脏和肾脏的绝对重量显著低于对照组(P0.05)。在血液学检查中,BBP-H组雄性大鼠的单核细胞数(Mon#)、单核细胞百分比(Mon%)和中性粒细胞数(Gran#)均显著高于对照组(P0.05),BBP-H组雌性大鼠的平均红细胞血红蛋白含量(MCH)和红细胞数(RBC)显著低于或高于对照组(P0.05)。血生化检测结果显示BBP-L组雄性大鼠的尿素(Urea)显著高于对照组(P0.05),BBP-L和BBP-H组雄性大鼠的镁离子(Mg)与对照组相比显著降低(P0.05);BBP-H组雌性大鼠的碱性磷酸酶(ALP)显著高于对照组(P0.05)。病理组织学结果显示BBP-H组和对照组之间未见差异。综上虽然在部分剂量的脏器绝对和相对重量、血液学和血清生化指标中观察到了一些变化,但未见相应的病理组织学变化,且均在大鼠的正常范围之内。这些结果提示在本实验条件下200 mg/kg BBP处理SD大鼠不产生BBP相关的毒性作用,BBP的无毒性作用量在200 mg/kg或以上。2.低剂量熊胆粉前期处理对肝癌的预防治疗效果。为了确认低剂量BBP前期处理对肝癌的预防治疗效果,本次实验利用遗传毒性致癌物N-二乙基亚硝胺(N-diethylnitrosamine,DEN)和N-亚硝基吗啉(N-nitrosomorpholine,NMOR)建立了两阶段致癌模型,进行了BBP的预防治疗肝癌药效实验。45只6周龄的SPF级SD雄性大鼠随机分为:Control组、DEN+NMOR组和DEN+NMOR+BBP组。首先给DEN+NMOR+BBP组灌胃给药10 mg/kg熊胆粉15周,DEN+NMOR和DEN+NMOR+BBP组动物在13周开始时腹腔注射200 mg/kg DEN一次,并在第15周开始饮水给药80ppm的NMOR一直到25周结束。最后对所有生存动物进行深度吸入麻醉后,腹主动脉放血处死,并大体解剖取出肝脏和肺脏进行称重。结果,第13周开始注射DEN和饮水给药NMOR的大鼠体重增长受到了抑制。但是,DEN+NMOR组和DEN+NMOR+BBP组之间体重、肝和肺的相对及绝对重量、生存率均没有统计学差异。病理组织学检查结果,DEN+NMOR组和DEN+NMOR+BBP组的肝癌发生率分别为19%和7%、肝腺瘤发生率分别为31%和33%,均无统计学差异。免疫组织学检查结果,DEN+NMOR+BBP组的细胞增殖活性生物标记物Ki67阳性细胞率显著低于DEN+NMOR组(P0.01)。DEN+NMOR+BBP组的大鼠肝癌癌前病灶生物标记物胎盘型谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase placental form,GST-P)阳性病灶的数量和面积与DEN+NMOR组相比,有减少的趋势。RT-qPCR结果显示BBP处理显著增加凋亡相关基因Caspase3、Caspase9的mRNA表达量(P0.05)。这些结果提示,BBP前期低剂量处理对DEN+NMOR诱导的肝癌有一定的预防治疗作用,其机制主要是通过诱导细胞凋亡通路Caspase-9/3的激活,抑制细胞的增殖活性,从而抑制癌前病灶的发生和发展。3.熊胆粉在肝癌不同时期对DNA修复基因表达水平的影响。前期低剂量处理BBP药效实验中我们发现BBP有抑制早期肝癌癌前病灶的趋势。同时,我们的早期肝癌促进阶段处理BBP的前期研究中也发现BBP对早期肝癌癌前病灶有显著的抑制作用。因此,为了检测BBP在肝癌的不同阶段,对DNA损伤的影响,利用RT-qPCR方法分析了BBP抗癌药效实验的肝组织中的DNA修复基因APE1,XRCC1,JWA的表达量。结果显示,在前期处理BBP的药效实验中,BBP显著增加了JWA mRNA的表达量(P0.05)。基于以上结果,我们又检测了早期肝癌促进阶段和中晚期肝癌的后期处理BBP药效实验中肝组织中的JWA的表达量,结果发现JWA的表达量均显著高于模型组。特别是,早期肝癌促进阶段处理BBP的肝组织中JWA的表达量显著高于对照组。然而,仅前期处理BBP和早期处理BBP能有效的抑制早期肝癌癌前病灶的发生和发展。这些结果表明,BBP通过上调环境应答基因JWA表达增强DNA的修复能力,从而抑制早期肝癌癌前病灶的发生发展。综上所述,使用低剂量BBP前期长期处理SD大鼠,在不产生毒副作用的基础上,还可通过诱导JWA表达量的增高增强DNA修复能力,抑制细胞增殖活性,诱导细胞凋亡相关基因Caspase3、Caspase9的高表达激活凋亡信号通路,减轻DEN和NMOR诱导的肝损伤,从而抑制肝癌的发生发展。此外,本研究结果表明JWA mRNA的高表达可能是BBP抑制早期肝癌发生发展的关键,但BBP介导JWA的抗癌机制需要进一步的探讨。