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抗缪勒氏管激素的单克隆抗体制备及其生物传感器检测方法研究

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抗缪勒氏管激素的单克隆抗体制备及其生物传感器检测方法研究

作者：刘雅楠重庆理工大学

学位级别：硕士

抗缪勒氏管激素(anti-Müllerian hormone,AMH)是反映卵巢储备功能、评价生育能力的主要标志物。AMH检测可用于胚胎性别鉴定;反映卵巢储备功能;诊断卵巢早衰、多囊卵巢综合症;男性不育的评估以及辅助生殖。与其他生育标志物相比,AMH浓... 详细信息

抗缪勒氏管激素(anti-Müllerian hormone,AMH)是反映卵巢储备功能、评价生育能力的主要标志物。AMH检测可用于胚胎性别鉴定;反映卵巢储备功能;诊断卵巢早衰、多囊卵巢综合症;男性不育的评估以及辅助生殖。与其他生育标志物相比,AMH浓度相对稳定,不受特定检测时间限制,不易受外界因素影响(如激素、药物、月经周期及妊娠影响),可随年龄的增长至25岁左右而降低,常作为临床检测的重要指标。AMH检测技术发展迅速,从早期的免疫细胞化学分析及放射免疫分析技术,再到酶联免疫吸附分析(ELISA),目前已经发展到全自动化学放光检测技术。免疫细胞化学分析只能定性,不能定量;放射免疫分析存在污染环境的风险,ELISA法操作简单,适合于大批量血清学调查,有较大的应用前景,但需反复洗涤,检测灵敏度有限;化学发光检测所需试剂、仪器昂贵,且需专业人员操作。因此探索高效、特异、低成本的检测手段对于AMH检测具有十分重要的意义。AMH现有的免疫学检测方法都是基于抗原抗体的反应,目前,国内生产的AMH抗原、抗体质量参差不齐,进口价格又十分昂贵。制备高效价、强特异性、低成本的AMH抗原抗体可为AMH的检测提供有效试剂。本文旨在制备特异性强、活性高的AMH抗原、抗体,并以此为试剂原料,研制基于CMWCNTs/NH2-Si O2修饰丝网电极的AMH高灵敏度电化学免疫传感器和基于GO集成微纳光纤耦合器的AMH生物传感器,为AMH诊断提供一种新的检测手段。本文研究内容如下:1、AMH抗原的制备分析并优化从NCBI基因库检索得到的人源AMH基因序列(登录号:NM00479.5),在AMH基因序列两端引入Ndel、Xhol酶切位点,化学合成AMH基因。将其融合至p ET28(+)载体中,构建p ET28a(+)-AMH重组质粒,再将重组质粒导入至大肠杆菌BL21中进行诱导表达。之后优化诱导条件,以最佳条件进行AMH的大量表达,利用镍离子亲和层析柱对AMH蛋白进行纯化,并进行一系列的生物学特性鉴定(纯度、浓度、特异性、反应原性)。2、AMH单克隆抗体的制备用上述制备的AMH重组蛋白与等体积佐剂混合,充分乳化后作为免疫原,采用长程免疫法免疫BALB/c小鼠。取4次免疫和1次加强免疫后小鼠的脾脏,制备脾细胞悬液,使用PEG1500将上述细胞悬液与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合。通过间接ELISA法,对融合细胞及亚克隆后的细胞上清进行重复筛选。将能够分泌稳定的单克隆细胞株扩大培养,腹腔注射入BALB/c小鼠体内诱生腹水单抗,利用Protein A柱对腹水进行纯化,对纯化得到的AMH抗体进行生物特性鉴定。3、研制基于CMWCNTs/NH2-Si O2修饰SPE的高灵敏度电化学免疫传感器通过溶胶凝胶法制备得到Si O2纳米球,加入APTES与Si-O-Si键结合,得到表面氨基化的二氧化硅;用EDC/NHS交联剂活化氨基化的二氧化硅纳米球使其易与羧基化的纳米管形成稳定的NHS酯,超声法与CMWCNTs混合得到复合材料;SEM电镜对其面扫及空间元素分布进行表征;然后通过物理作用将CMWCNTs固定在丝网电极表面,并利用酰胺键结合Si O2纳米粒、肽键共价结合AMH重组蛋白,修饰后经CV循环伏安法对电极材料进行电化学表征,证明材料成功修饰于电极表面;并对构建的传感器进行灵敏度、重复性、特异性及临床性鉴定。4、建立基于微纳光纤耦合器的AMH快速检测方法通过在直径为6μm的微纳光纤耦合器上以共价键结合氧化石墨烯(GO),构成GO集成螺旋微纳光纤耦合器(DHMC)的生物传感器;将GO沉积在DHMC表面上的连接层,为抗体分子提供增强的局部倏逝光场和丰富的键合位点,在传感器表面修饰AMH单克隆抗体作为目标分子识别单元,共价结合不同浓度的AMH抗原进行免疫学检测,如特异性、临床性实验。结果:1、经双酶切鉴定及测序结果显示:在1689 bp处出现明显基因条带,表明p ET28a(+)-AMH重组质粒构建成功。优化后的p ET28a(+)-AMH工程菌最佳的IPTG诱导表达条件为:30℃、0.8 mmol/L、10h。纯化的AMH蛋白经SDS-PAGE鉴定达到了电泳级纯度,且BCA鉴定测得蛋白浓度为0.7 mg/m L;Western-blot鉴定结果显示在62 k D处出现清晰的印迹条带,与预期结果相符,孵育市售AMH抗体后ELISA测定结果反应强烈,表明AMH反应原性良好。2、小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合制备AMH单抗的过程中,细胞融合率为100%。对融合后细胞进行了3次克隆化成功得到6株稳定分泌AMH抗体的单克隆细胞,命名为5-G12,5-G11,5-C7,2-B12,1-H3,1-F5。选择两株效价较高的5-G12(亚型Ig G1型)、5-G11(亚型Ig G2b型)进行扩大培养,制备腹水并纯化。SDS-PAGE电泳鉴定显示在25 k D及50 k D处出现清晰条带,

关键词：抗缪勒氏管激素原核表达单克隆抗体多壁碳纳米管电化学生物传感器微纳光纤耦合器

抗缪勒氏管激素与性激素联合检测在多囊卵巢综合征中的诊断价值

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临床医药实践 2023年第2期32卷 104-107页

作者：黄健赣州市妇幼保健院江西赣州341000

目的:分析抗缪勒氏管激素(AMH)与性激素联合检测在多囊卵巢综合征(PCOS)中的诊断价值。方法:选择2020年1月-2021年12月收治的50例PCOS患者为观察组,另选取同期体检的50例健康女性为对照组。比较两组AMH与性激素水平,分析AMH与性激素联... 详细信息

目的:分析抗缪勒氏管激素(AMH)与性激素联合检测在多囊卵巢综合征(PCOS)中的诊断价值。方法:选择2020年1月-2021年12月收治的50例PCOS患者为观察组,另选取同期体检的50例健康女性为对照组。比较两组AMH与性激素水平,分析AMH与性激素联合检测在PCOS中的诊断价值。结果:观察组AMH、促黄体生成素(LH)、睾酮(T)、LH/促卵泡生成素(FSH)水平高于对照组,差异有统计学意义(P0.05)。绘制受试者工作曲线(ROC)发现,血清AMH,LH,T及LH/FSH水平单独及联合诊断PCOS的曲线下面积(AUC)均>0.80,均有一定预测价值,当四者cut-off值分别取6.525 ng/mL,9.945 mIU/mL,15.590 ng/dL,2.500时,诊断价值最佳。结论:AMH与性激素联合检测对PCOS有较高诊断价值,可为临床诊治提供参考。

关键词：多囊卵巢综合征抗缪勒氏管激素性激素诊断价值

抗缪勒氏管激素磁微粒化学发光检测方法学建立及在性早熟疾病诊断中的应用

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抗缪勒氏管激素磁微粒化学发光检测方法学建立及在性早熟疾病诊断...

作者：李思思扬州大学

学位级别：硕士

抗缪勒氏管激素(anti-Mullerian hormone,AMH)作为评价卵巢储备功能的最有效标志物之一,不仅在女性生殖领域受到临床医师的重视,在新生儿和儿童内分泌疾病方面也引起越来越广泛的关注。因此,人体血清AMH浓度的检测逐渐成为医学实验室必... 详细信息

抗缪勒氏管激素(anti-Mullerian hormone,AMH)作为评价卵巢储备功能的最有效标志物之一,不仅在女性生殖领域受到临床医师的重视,在新生儿和儿童内分泌疾病方面也引起越来越广泛的关注。因此,人体血清AMH浓度的检测逐渐成为医学实验室必须普及的项目,但AMH的检测方法和参考区间并无统一标准。迄今为止,国外已有多种AMH检测技术,而国内目前对AMH诊断试剂的研究尚处于发展阶段,本研究建立的抗缪勒氏管激素磁微粒化学发光检测方法,可快速、高敏感、高特异地对AMH进行检测。第一部分抗缪勒氏管激素磁微粒化学发光检测方法学建立为了对AMH体外诊断检测方法予以创新并在临床应用上提供参考依据,本研究通过试剂的筛选、反应体系及检测流程的优化、分析性能评价、参考值确立和稳定性研究等方面,来进行AMH磁微粒化学发光方法学的建立。结果显示:1试剂的选择方面,我们最终确定北京泽诚生物技术有限公司的AMH抗原2和AMH偶联物 Anti-AMH-AP(1.Oμg/mL)、Anti-AMH-FITC(0.5μg/mL)作为本方法建立的主要试剂。2反应体系及检测流程的优化方面,我们选择在AMH抗试剂的Tris缓冲液中添加0.5%BSA,并使用蛋白缓冲液 BUF3(Tris-HCl 缓冲液,150mmol/L,PH7.5,含 0.5%BSA、0.05%proclin300)配制校准品,以保证试剂及反应系统的稳定性。将加样模式定为30μL样本+30μL抗试剂A+30μL抗试剂B 15min+30μL磁微粒试剂5min+300μL清洗液清洗3次+200μL底物后在发光检测仪上进行测试。3分析性能评估方面,通过精密度、准确度、特异性、空白检出限、线性范围、方法学比对及钩状效应等对本方法予以评价。质控品1和质控品2的批内CV分别为2.31%和1.89%,批间CV分别为3.79%和6.64%;准确度在±4%之内,添加回收率96%;空白检出限达0.05ng/mL;在零含量AMH样本中分别加入100ng/mL抑制素A、100ng/mL激活素A、500mIU/mL 的黄体生成素(luteinizinghormone,LH),测得结果均不高于 0.07ng/mL,特异性较好,符合特异性检测要求;线性范围在0.07ng/mL-20ng/mL内,相关系数r=0.999;待测标本的AMH水平高达800ng/mL时仍未观察到钩状效应;本法和罗氏电化学发光法检验结果具有高度一致性,直线回归方程Y=0.996X+0.029,r=0.997,相关性良好。4通过对560份正常人样本的AMH检测值进行分析,采用百分位数法确定AMH的参考值范围。健康男性:1.43ng/mL-1 1.6ng/mL:健康女性:20-24 岁(1.66ng/mL-9.49ng/mL):25-29 岁(1.18ng/mL-9.16ng/mL);30-34 岁(0.672ng/mL-7.55ng/mL);35-39 岁(0.777ng/mL-5.24ng/mL);40-44 岁(0.097ng/mL-2.96ng/mL);45-50 岁(0.046ng/mL-2.06ng/mL)。5通过对试剂加速稳定性和开瓶稳定性分析,发现抗试剂在37℃条件下加速破坏9天后效价下降30%左右,校准品开瓶8h后稳定性良好,未见明显降解。本研究结果表明,抗缪勒氏管激素磁微粒化学发光定量方法的主要性能指标均满足了临床检测要求,灵敏度高,特异性强,适于临床推广使用。第二部分中枢性性早熟女童血清抗缪勒氏管激素的水平变化及意义为评价青春期前后女童的卵巢储备功能以及AMH对中枢性性早熟(centralprecocious puberty,CPP)的辅助诊断价值,我们应用新建立的方法对5-8岁CPP女童及正常发育女童进行血清AMH水平测定,比较了两组女童的卵巢功能是否具有显著性差异,并通过受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC曲线)判断AMH对女童CPP疾病的诊断效能。结果显示AMH水平在CPP女童中较正常女童有所上升(2.80ng/mL vs.2.10ng/mL),差异具有统计学意义(P<0.05),且身高及体重均明显增加。曲线下面积(areaundercurve,AUC)为0.681,当约登指数达到最大时,截取的AMH最佳诊断水平为2.0ing/mL。其中,灵敏度达到了 75%,特异度为63.33%。上述结果表明血清AMH水平对CPP女童的诊断具有一定的参考价值,为临床上评价CPP女童的卵巢储备及诊疗方案提供了一种新的思路。

关键词：磁微粒化学发光法抗缪勒氏管激素方法学评价中枢性性早熟 ROC曲线

抗缪勒氏管激素量子点荧光免疫检测试剂的性能评价

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药物生物技术 2018年第5期25卷 410-412页

作者：蒋业忠许高云张名媛马鞍山市人民医院妇产科安徽马鞍山243000

抗缪勒氏管激素(AMH)是由卵巢窦前卵泡和小窦卵泡的颗粒细胞所分泌的一种糖蛋白,对于卵泡发育具有重要的调节作用,其血清水平直接受发育中窦卵泡的数量的影响,因此能够直接反映卵巢储备功能。对抗缪勒氏管激素(Anti-Muellerian hormone,... 详细信息

抗缪勒氏管激素(AMH)是由卵巢窦前卵泡和小窦卵泡的颗粒细胞所分泌的一种糖蛋白,对于卵泡发育具有重要的调节作用,其血清水平直接受发育中窦卵泡的数量的影响,因此能够直接反映卵巢储备功能。对抗缪勒氏管激素(Anti-Muellerian hormone,AMH)量子点荧光免疫法床旁快速检测试剂进行性能评价,判断其是否可以满足临床需求,并评估该试剂是否可以准确检测女性的卵巢功能。基于量子点荧光免疫层析技术制备AMH全血检测试剂盒,建立AMH全血检测体系,评估该检测试剂的日间和日内精密度、定量限和线性范围,验证了该试剂与Beckman化学发光法AMH检测试剂的量值一致性以及该试剂诊断卵巢相关疾病的准确性。该试剂盒日内和日间精密度均小于15%;定量限<0. 1 ng/m L,线性范围为0. 11~16. 1 ng/m L。该试剂与Beckman化学发光法AMH检测试剂的相关系数为0. 96。对表面健康人群、卵巢早衰(Premature ovarian failure,POF)患者和多囊卵巢综合征(Polycystic ovary syndrome,PCOS)患者的血清AMH浓度的结果表明该方法诊断卵巢早衰的准确度为100%,诊断PCOS的特异性和灵敏度分别为91. 1和95. 2%。AMH量子点荧光免疫法床旁快速检测试剂具有良好的性能,且能够准确评估患者卵巢功能,对于不孕患者的病因筛查、快速诊断及医生制定治疗方案的指导具有重要价值。

关键词：抗缪勒氏管激素床旁快检多囊卵巢综合征性能验证量子点荧光免疫卵巢早衰

抗缪勒氏管激素和相关临床因素间关系的初步探索

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抗缪勒氏管激素和相关临床因素间关系的初步探索

作者：雷晨慧苏州大学

学位级别：硕士

研究背景抗缪勒氏管激素AMH是一种属于转化生长因子β家族的二聚体糖蛋白,由Professor Alfred Jost于1947年首先发现。男性体内AMH主要由睾丸的支持细胞分泌,其主要作用为胚胎发育中诱导缪勒管的退化和支持男性正常生殖道的正常发育。AM... 详细信息

研究背景抗缪勒氏管激素AMH是一种属于转化生长因子β家族的二聚体糖蛋白,由Professor Alfred Jost于1947年首先发现。男性体内AMH主要由睾丸的支持细胞分泌,其主要作用为胚胎发育中诱导缪勒管的退化和支持男性正常生殖道的正常发育。AMH在睾丸中持续生成直至青春期,随后缓慢减少,至青春期结束则男性血清AMH水平已无法检测出。女性体内AMH早期由始基卵泡分泌,但其分泌高峰位于窦前卵泡和小的窦状卵泡(直径激素测量数据及其BMI、月经初潮年龄、孕产史与AMH值之间的关系,探索病例组AMH值与相应年龄的健康组女性AMH值之间的差异。2、对健康组AMH数据进行对数数据处理并采用回归分析筛选并建立相对理想的AMH值预测方程模型。3、选取2015年7月-2015年8月在我科电化学发光实验室测定血清AMH的健康女性共27例作为内部验证组,选取2018年1月-2018年2月在我科电化学发光实验室测定AMH值的健康女性共37例作为外部验证组,对基于健康组建立的AMH和年龄之间的适用函数进行内部和外部验证,以检验其作为预测AMH值的准确性和可靠性。4、运用Microsoft Excel 2007和SPSS软件对数据进行整理及统计学分析,采用单因素方差分析、秩和检验及卡方检验分析各亚组临床因素的组间差异;皮尔森相关分析及秩和检验分析血清AMH值和各临床因素之间的相关关系;t检验及秩和检验分析验证组及健康组的血清AMH值的差异;t检验分析健康组及病例组血清AMH值的差异。结果1、本研究646例女性中,纳入健康组的女性为484例,年龄20-52岁,平均年龄为31.58±6.29岁,根据年龄又将其分为5个亚组,20-24岁、25-29岁、30-34岁、35-39岁、40-55岁,各年龄亚组例数分别为53、189、112、80和50例。健康组中262例女性测量了性激素,包括bE2,bFSH,bLH以及T;464例(95.87%)女性提供了既往孕产史。3组病例组中,PCOS组14例,习惯性流产组30例,月经周期不规律组118例。2、健康组中各年龄段亚组间临床基本因素比较显示初潮年龄差异不具有统计学意义(c=6.014,P>0.05),而BMI(F=9.650,P0.05)。外部验证组女性年龄为32.87±7.65岁,血清AMH值为4.31(3.34-4.87)ng/mL,将验证组健康女性代入方程中得出相应血清AMH值为4.32(3.1-4.64)ng/mL,统计学分析显示二组数据间的差异不具有统计学意义(Z=-1.524,P>0.05)。5、同时测量基础性激素的262例健

关键词：抗缪勒氏管激素临床因素卵巢储备电化学发光法

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抗缪勒氏管激素在生殖领域中的相关应用

临床医学进展 2022年第8期12卷 7053-7058页

作者：刘利君李泽武陈亚楠顾玉婷石城杨爱军济宁医学院临床医学院山东济宁济宁医学院附属医院山东济宁

抗缪勒氏管激素(anti-mullerian hormone, AMH)是转化生长因子-β超家族成员之一,主要由卵巢的颗粒细胞分泌。近年来随着人们对AMH研究的深入,提议将AMH作为多囊卵巢综合征的诊断标准之一,AMH在生殖领域的作用越来越广泛。AMH在预测绝... 详细信息

抗缪勒氏管激素(anti-mullerian hormone, AMH)是转化生长因子-β超家族成员之一,主要由卵巢的颗粒细胞分泌。近年来随着人们对AMH研究的深入,提议将AMH作为多囊卵巢综合征的诊断标准之一,AMH在生殖领域的作用越来越广泛。AMH在预测绝经年龄、评估卵巢储备等方面发挥重要作用,最新提出使用AMH来评价卵母细胞质量、胚胎质量及妊娠结局。本文旨在探讨血清AMH对卵泡发育、多囊卵巢综合征(polycystic ovarian syndrome, PCOS)诊断及其辅助生殖方面的应用价值。

关键词：抗缪勒氏管激素多囊卵巢综合征卵泡发育绝经年龄生殖技术

抗缪勒氏管激素与多囊卵巢综合征指标相关性分析及其诊断价值

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抗缪勒氏管激素与多囊卵巢综合征指标相关性分析及其诊断价值

作者：刘莎莎延安大学

学位级别：硕士

目的:通过研究多囊卵巢综合征(Polycystic Ovary Syndrome,PCOS)不同临床特征患者抗缪勒氏管激素(anti-mullerian hormone,AMH)的分泌特点及其相关性,为PCOS的发生发展提供一定的理论依据,同时对于该疾病评估、临床诊断提供一定的参考... 详细信息

目的:通过研究多囊卵巢综合征(Polycystic Ovary Syndrome,PCOS)不同临床特征患者抗缪勒氏管激素(anti-mullerian hormone,AMH)的分泌特点及其相关性,为PCOS的发生发展提供一定的理论依据,同时对于该疾病评估、临床诊断提供一定的参考。方法:选取2017年07月到2018年12月于延安大学附属医院妇科门诊或生殖科门诊就诊的患者为受试对象。按照2003年Rotterdam(鹿特丹)的诊断标准,诊断158名的已有性生活史的PCOS患者,根据其月经周期长短、体重指数、总睾酮水平及胰岛素抵抗与非胰岛素抵抗四种不同临床特征进行分组,比较各分组AMH水平及其他各项指标的差异,同时选择因输卵管或男方等因素在生殖科助孕治疗、健康志愿者及孕前体检的96例卵巢功能正常的女性为对照组。所有数据均使用统计学软件SPSS 22.0进行统计学分析。结果:1.PCOS组与对照组相比,血清AMH、卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)、LH/FSH、雌二醇(E2)、睾酮(T)、胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)及体重指数(BMI)均具有统计学差异(P0.05)。4.三组不同体重指数的PCOS患者比较,其AMH、LH、T及LH/FSH均有显著差异(P0.05);而在不同体重指数组AMH比较中,BMI为248组与BMI≥28组AMH无显著差异(P>0.05);余两两组间比较均有显著差异(P抗组与非胰岛素抵抗组PCOS患者比较,其AMH、BMI、FSH、LH、LH/FSH、T、及E2均具有显著差异(P抗组AMH水平明显高于非胰岛素抵抗组。6.不同总睾酮水平组PCOS患者比较,其AMH、BMI、FSH、LH、LH/FSH、E2及HOMA-IR均具有显著差异(P5.15 ng/ml对PCOS的诊断具有较高的特异性及敏感性,可为临床诊断提供参考。3.AMH与月经周期长短、BMI、HOMA-IR及T呈正相关关系,AMH有助于判断PCOS患者的病情严重程度。

关键词：抗缪勒氏管激素多囊卵巢综合征月经周期体重指数胰岛素抵抗高雄激素血症

抗缪勒氏管激素和性激素水平在预测卵巢储备功能中的价值

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检验医学与临床 2021年第12期18卷 1670-1672页

作者：袁博宋俊刘路成南方科技大学医院检验科广东深圳518052

目的探讨抗缪勒氏管激素(AMH)和性激素水平在预测卵巢储备功能中的价值。方法选取2019年1—12月于该院收治的142例妇科患者,根据其卵巢储备功能不同,分为正常组、卵巢储备功能减退(DOR)组和卵巢早衰(POF)组,分别检测各组AMH、卵泡刺激素... 详细信息

目的探讨抗缪勒氏管激素(AMH)和性激素水平在预测卵巢储备功能中的价值。方法选取2019年1—12月于该院收治的142例妇科患者,根据其卵巢储备功能不同,分为正常组、卵巢储备功能减退(DOR)组和卵巢早衰(POF)组,分别检测各组AMH、卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)及雌二醇(E2)水平,并绘制受试者工作特征曲线(ROC曲线)进行灵敏度和特异度分析。结果与正常组比较,DOR组、POF组血清AMH及E2水平明显降低,而FSH、LH水平明显升高,差异均有统计学意义(P激素与卵巢储备功能密切相关,具有一定的预测价值,当进行联合检测时,其检测灵敏度和特异度更好,具有重要的临床意义。

关键词：抗缪勒氏管激素性激素卵巢储备功能

花[魚骨]抗缪勒氏管激素基因克隆、抗体制备及其对外源雌激素的响应

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南方农业学报 2022年第10期53卷 2778-2786页

作者：张李敏郭琦王向斌黄茜李学军周传江赵道全张建新刘慧芬河南师范大学水产学院/河南省水产动物养殖工程技术研究中心河南新乡453007 河南省黄河流域伊洛河水生生物野外科学观测研究站河南郑州450000

【目的】克隆花[魚骨]抗缪勒氏管激素基因Amh,分析其序列特征及亚细胞定位,检测不同浓度雌二醇处理下的表达变化规律,为后续研究Amh基因的功能及其在卵巢发育中分子机制提供理论参考。【方法】基于花[魚骨]转录组文库测序结果,克隆Amh基... 详细信息

【目的】克隆花[魚骨]抗缪勒氏管激素基因Amh,分析其序列特征及亚细胞定位,检测不同浓度雌二醇处理下的表达变化规律,为后续研究Amh基因的功能及其在卵巢发育中分子机制提供理论参考。【方法】基于花[魚骨]转录组文库测序结果,克隆Amh基因cDNA序列,并对其进行生物信息学分析。构建重组表达质粒pET32a-Amh,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,用纯化的重组蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体。通过免疫荧光技术检测荧光信号确定蛋白的亚细胞定位情况。同时,利用实时荧光定量PCR检测Amh基因在雌二醇处理后的表达情况。【结果】克隆的花[魚骨]Amh基因cDNA序列全长为1849 bp,开放阅读框(ORF)为1671 bp,编码556个氨基酸残基。系统进化分析结果显示,花[魚骨]Amh基因与斑马鱼、鲤鱼等鲤科鱼类Amh基因聚为一支,表明其亲缘关系较近。将纯化的AMH重组蛋白免疫小鼠以制备AMH多克隆抗体,通过酶联免疫方法(ELISA)检测其抗体效价为2.4×106以上,Western blotting检测显示抗体具有特异性。AMH蛋白在花[魚骨]卵巢颗粒细胞表达。利用不同浓度的雌二醇处理花?60 d后发现,低浓度雌二醇(100μg/g)促进花?卵母细胞生长,卵巢内皮质液泡数量增多。经雌二醇处理后,卵巢中Amh基因的表达量降低,说明雌激素在卵巢发育中对Amh基因表达具有抑制作用。【结论】Amh基因含有TGF-β家族典型的结构域,在卵巢颗粒细胞表达,且响应雌激素的调控,可能在花?卵巢发育中发挥调控作用。

关键词：花[魚骨] 抗缪勒氏管激素基因克隆多克隆抗体雌激素