抗缪勒氏管激素的单克隆抗体制备及其生物传感器检测方法研究

作     者：刘雅楠 

作者单位：重庆理工大学 

学位级别：硕士

导师姓名：吴胜昔

授予年度：2023年

学科分类：100208[医学-临床检验诊断学] 1002[医学-临床医学] 10[医学] 

主      题：抗缪勒氏管激素 原核表达 单克隆抗体 多壁碳纳米管 电化学生物传感器 微纳光纤耦合器 

摘      要：抗缪勒氏管激素（anti-Müllerian hormone,AMH）是反映卵巢储备功能、评价生育能力的主要标志物。AMH检测可用于胚胎性别鉴定;反映卵巢储备功能;诊断卵巢早衰、多囊卵巢综合症;男性不育的评估以及辅助生殖。与其他生育标志物相比,AMH浓度相对稳定,不受特定检测时间限制,不易受外界因素影响（如激素、药物、月经周期及妊娠影响）,可随年龄的增长至25岁左右而降低,常作为临床检测的重要指标。AMH检测技术发展迅速,从早期的免疫细胞化学分析及放射免疫分析技术,再到酶联免疫吸附分析（ELISA）,目前已经发展到全自动化学放光检测技术。免疫细胞化学分析只能定性,不能定量;放射免疫分析存在污染环境的风险,ELISA法操作简单,适合于大批量血清学调查,有较大的应用前景,但需反复洗涤,检测灵敏度有限;化学发光检测所需试剂、仪器昂贵,且需专业人员操作。因此探索高效、特异、低成本的检测手段对于AMH检测具有十分重要的意义。AMH现有的免疫学检测方法都是基于抗原抗体的反应,目前,国内生产的AMH抗原、抗体质量参差不齐,进口价格又十分昂贵。制备高效价、强特异性、低成本的AMH抗原抗体可为AMH的检测提供有效试剂。本文旨在制备特异性强、活性高的AMH抗原、抗体,并以此为试剂原料,研制基于CMWCNTs/NH2-Si O2修饰丝网电极的AMH高灵敏度电化学免疫传感器和基于GO集成微纳光纤耦合器的AMH生物传感器,为AMH诊断提供一种新的检测手段。本文研究内容如下:1、AMH抗原的制备分析并优化从NCBI基因库检索得到的人源AMH基因序列（登录号:NM00479.5）,在AMH基因序列两端引入Ndel、Xhol酶切位点,化学合成AMH基因。将其融合至p ET28（+）载体中,构建p ET28a（+）-AMH重组质粒,再将重组质粒导入至大肠杆菌BL21中进行诱导表达。之后优化诱导条件,以最佳条件进行AMH的大量表达,利用镍离子亲和层析柱对AMH蛋白进行纯化,并进行一系列的生物学特性鉴定（纯度、浓度、特异性、反应原性）。2、AMH单克隆抗体的制备用上述制备的AMH重组蛋白与等体积佐剂混合,充分乳化后作为免疫原,采用长程免疫法免疫BALB/c小鼠。取4次免疫和1次加强免疫后小鼠的脾脏,制备脾细胞悬液,使用PEG1500将上述细胞悬液与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合。通过间接ELISA法,对融合细胞及亚克隆后的细胞上清进行重复筛选。将能够分泌稳定的单克隆细胞株扩大培养,腹腔注射入BALB/c小鼠体内诱生腹水单抗,利用Protein A柱对腹水进行纯化,对纯化得到的AMH抗体进行生物特性鉴定。3、研制基于CMWCNTs/NH2-Si O2修饰SPE的高灵敏度电化学免疫传感器通过溶胶凝胶法制备得到Si O2纳米球,加入APTES与Si-O-Si键结合,得到表面氨基化的二氧化硅;用EDC/NHS交联剂活化氨基化的二氧化硅纳米球使其易与羧基化的纳米管形成稳定的NHS酯,超声法与CMWCNTs混合得到复合材料;SEM电镜对其面扫及空间元素分布进行表征;然后通过物理作用将CMWCNTs固定在丝网电极表面,并利用酰胺键结合Si O2纳米粒、肽键共价结合AMH重组蛋白,修饰后经CV循环伏安法对电极材料进行电化学表征,证明材料成功修饰于电极表面;并对构建的传感器进行灵敏度、重复性、特异性及临床性鉴定。4、建立基于微纳光纤耦合器的AMH快速检测方法通过在直径为6μm的微纳光纤耦合器上以共价键结合氧化石墨烯（GO）,构成GO集成螺旋微纳光纤耦合器（DHMC）的生物传感器;将GO沉积在DHMC表面上的连接层,为抗体分子提供增强的局部倏逝光场和丰富的键合位点,在传感器表面修饰AMH单克隆抗体作为目标分子识别单元,共价结合不同浓度的AMH抗原进行免疫学检测,如特异性、临床性实验。结果:1、经双酶切鉴定及测序结果显示:在1689 bp处出现明显基因条带,表明p ET28a（+）-AMH重组质粒构建成功。优化后的p ET28a（+）-AMH工程菌最佳的IPTG诱导表达条件为:30℃、0.8 mmol/L、10h。纯化的AMH蛋白经SDS-PAGE鉴定达到了电泳级纯度,且BCA鉴定测得蛋白浓度为0.7 mg/m L;Western-blot鉴定结果显示在62 k D处出现清晰的印迹条带,与预期结果相符,孵育市售AMH抗体后ELISA测定结果反应强烈,表明AMH反应原性良好。2、小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合制备AMH单抗的过程中,细胞融合率为100%。对融合后细胞进行了3次克隆化成功得到6株稳定分泌AMH抗体的单克隆细胞,命名为5-G12,5-G11,5-C7,2-B12,1-H3,1-F5。选择两株效价较高的5-G12（亚型Ig G1型）、5-G11（亚型Ig G2b型）进行扩大培养,制备腹水并纯化。SDS-PAGE电泳鉴定显示在25 k D及50 k D处出现清晰条带,与Ig G型抗体的轻链及重链大小相符合,表明纯化后的单抗纯度较高,且BCA蛋白定量测定浓度为1.08mg/m L。Western blot鉴定结果显示,制备的单抗可与AMH重组蛋白特异性结合,目的条带与预期相符,ELISA测定纯化后腹水效价可达到1:1024000。3、成功搭建电化学免疫传感器平台并建立了AMH检测方法。利用差分脉冲伏安法测定得到AMH抗原的检测范围为1fg/m L-100ng/m L、检测限LOD为0.15 fg/m L,且对应线性方程R2=0.9807。通过4次重复性实验可见,同一浓度的电流变化较小,重复性良好。将AMH及不同血清标志物（如:AFP、DCP、ST2）进行DPV检测,结果显示仅AMH的样品引起的电流效应强烈,电流变化量达130μA,不含AMH标志物的样品电流变化不明显,表明传感器良好的特异性。此外将三组阴性临床样本与六组阳性临床样本浓度稀释50倍,均能够检出血清样本中的标志物且阴阳组电流信号差异显著,电流差在60μA左右,结果表明传感器临床性良好。4、将构建的DHMC传感器经过功能化修饰（如羟基化、硅烷化、沉淀GO、活化羧基、固定AMH单克隆抗原、封闭结合位点）,利用光谱仪监测分析,可见随折射率RI浓度的增加,光谱不断向右红移。灵敏度实验结果显示,50μg/m L时光谱趋于平稳,得到光谱灵敏度范围为200 fg/m L-50μg/m L,检测限低于200fg/m L。通过选取3组AMH临床样本及AFP、DCP进行特异临床实验,可见DHMC特异性良好,具有临床运用价值。结论本文成功通过原核表达系统制备了高活性AMH蛋白,经PEG法细胞融合、亚克隆筛选制备了高效价、特异性强的AMH单克隆抗体。并构建了基于CMWCNTs/NH2-Si O2修饰丝网电极的AMH高灵敏度电化学免疫传感器和基于微纳光纤耦合器的AMH生物传感器,从灵敏度、重复性、特异性以及临床性四方面对两种检测方法进行评估,结果表明两种方法均具有灵敏度高、重复性好、特异性强等特点,可用于临床样品AMH的检测,为AMH的检测提供了新的检测技术,具有重要临床应用前景。