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赤羽病病毒N蛋白原核表达及单克隆抗体的制备

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生物工程学报 2024年第5期40卷 1548-1558页

作者：林永玉石正旺罗俊聪朱昱茜席韬周静张帆石鑫泰王川田宏甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070 中国农业科学院兰州兽医研究所、兰州大学动物医学与生物安全学院、动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730000

为制备赤羽病病毒(akabane virus,AKAV) N蛋白的单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb),本研究利用原核表达系统表达了AKAV N蛋白,纯化后免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合获得杂交瘤细胞,采用间接酶联免疫吸附方法(enz... 详细信息

为制备赤羽病病毒(akabane virus,AKAV) N蛋白的单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb),本研究利用原核表达系统表达了AKAV N蛋白,纯化后免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合获得杂交瘤细胞,采用间接酶联免疫吸附方法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)筛选获得阳性杂交瘤细胞。经3次亚克隆筛选得到两株特异性针对AKAV N蛋白的杂交瘤细胞株,分别命名为2C9与5E9。通过ELISA、免疫印迹(Western blotting)、间接免疫荧光法(indirect immunofluorescence assay,IFA)对其进行鉴定。结果显示,成功筛选到特异性针对AKAV N蛋白的单克隆抗体。IFA发现其与AKAV N蛋白具有良好的反应性,亚型鉴定试剂盒鉴定2C9 mAb重链为IgG2b型,轻链为κ链;5E9 mAb重链为IgG1型,轻链为κ链;ELISA检测效价均为1:4 096 000。本研究成功制备了两株特异性针对AKAV N蛋白的单克隆抗体,为赤羽病诊断方法的开发、疾病的防控以及AKAV N蛋白功能的研究奠定了基础。

关键词：赤羽病病毒 N蛋白原核表达单克隆抗体

丹参Sm14-3-3蛋白基因克隆、诱导模式及原核表达分析

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中国中药杂志 2022年第18期47卷 4886-4894页

作者：时晨晶王世威彭佳铭许海玉天津中医药大学天津301617 广东药科大学中药学院广东广州510006 安徽中医药大学药学院安徽合肥230012 中国中医科学院中药研究所北京100700

14-3-3蛋白是植物体内一类重要的调控蛋白,对植物的生长发育及生物和非生物胁迫都具有重要的调控作用。该研究利用酵母双杂交从药用植物丹参cDNA文库中筛选并克隆到1个编码14-3-3蛋白基因(GenBank登录号为OM683281),该基因开放阅读框(O... 详细信息

14-3-3蛋白是植物体内一类重要的调控蛋白,对植物的生长发育及生物和非生物胁迫都具有重要的调控作用。该研究利用酵母双杂交从药用植物丹参cDNA文库中筛选并克隆到1个编码14-3-3蛋白基因(GenBank登录号为OM683281),该基因开放阅读框(ORF)由780 bp组成,编码259个氨基酸。生物信息学分析预测该蛋白的分子式为C_(1287)H_(2046)N_(346)O_(422)S_(9),相对分子质量29.4 kDa,不含信号肽,为非跨膜蛋白。通过基因同源序列比对及进化树分析,证明该基因确实属于14-3-3蛋白家族,与拟南芥、水稻中的14-3-3蛋白基因家族亲缘关系较近。将丹参14-3-3基因构建到原核表达载体pGEX-4T-1上,在大肠杆菌BL21中,成功表达出重组蛋白。实时荧光定量PCR检测,确定该基因在丹参根、茎、叶、花不同组织部位中表达,叶中表达量最高,茎中次之,花中的表达量最低。15%PEG模拟干旱、植物激素水杨酸、茉莉酸甲酯和乙烯利诱导丹参植株,14-3-3基因表达水平在诱导的早期出现峰值,表明该基因能够快速响应干旱等非生物胁迫和水杨酸、茉莉酸、乙烯等植物激素处理。为后续研究14-3-3蛋白调控丹参酮生物合成及响应生物和非生物胁迫的分子机制奠定基础。

关键词：丹参 14-3-3蛋白基因克隆原核表达诱导模式

家蚕几丁质去乙酰化酶BmCDA2的基因表达和免疫定位

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生物工程学报 2023年第4期39卷 1655-1669页

作者：何允陈怡菲王清浪张自钰董浩南申太霞侯勇龚竞西南大学家蚕基因组生物学国家重点实验室重庆400715 西南大学蚕桑纺织与生物质科学学院重庆400715 西南大学前沿交叉学科研究院生物学研究中心重庆400715

几丁质的去乙酰化修饰与昆虫的发育变态密切相关,几丁质去乙酰化酶(chitin deacetylase,CDA)是这个过程中的关键酶。家蚕(Bombyx mori)是鳞翅目昆虫的代表性昆虫,目前对家蚕CDAs的研究较少。为了更好地揭示BmCDAs对家蚕变态发育的作用,... 详细信息

几丁质的去乙酰化修饰与昆虫的发育变态密切相关,几丁质去乙酰化酶(chitin deacetylase,CDA)是这个过程中的关键酶。家蚕(Bombyx mori)是鳞翅目昆虫的代表性昆虫,目前对家蚕CDAs的研究较少。为了更好地揭示BmCDAs对家蚕变态发育的作用,本研究采用生物信息学分析、蛋白表达纯化以及免疫荧光定位等方法对表皮中高量表达的BmCDA2进行了研究。结果发现,BmCDA2有两种mRNA拼接形式BmCDA2a和BmCDA2b,分别在幼虫眠期和化蛹期表皮高量表达,两个基因均有几丁质去乙酰化酶催化结构域(catalytic domain)、几丁质结合结构域(chitin binding domain)和低密度脂蛋白受体结构域(low density lipoprotein receptor domain);Western blotting结果显示,该蛋白在表皮存在,荧光免疫定位发现BmCDA2蛋白随着幼虫新表皮的生成而逐渐增多,推测BmCDA2可能参与了幼虫新表皮的形成。该结果丰富了家蚕CDAs的生物学功能信息,也为其他昆虫CDA的研究提供一些有价值的参考。

关键词：家蚕几丁质去乙酰化酶2 原核表达免疫荧光定位

呼吸道合胞病毒NS1蛋白鼠单克隆抗体的制备

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生物工程学报 2024年第5期40卷 1536-1547页

作者：陈娇王亚娟陈志华茹毅郑海学裴晶晶中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730000 甘肃省病原生物学基础学科研究中心甘肃兰州730046 兰州理工大学生命科学与工程学院甘肃兰州730050

本研究旨在制备抗呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)非结构蛋白1(nonstructural protein 1,NS1)单克隆抗体,以分析在转染和感染过程中NS1蛋白的表达和分布情况,并评估其在免疫沉淀反应中的应用价值。将NS1基因片段构建... 详细信息

本研究旨在制备抗呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)非结构蛋白1(nonstructural protein 1,NS1)单克隆抗体,以分析在转染和感染过程中NS1蛋白的表达和分布情况,并评估其在免疫沉淀反应中的应用价值。将NS1基因片段构建至原核表达质粒,经大肠杆菌表达、亲和层析纯化后得到NS1蛋白,将纯化的蛋白免疫小鼠后,通过间接酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)技术筛选能稳定分泌NS1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并将该单抗用于间接免疫荧光(indirect immunofluorescence assay,IFA)与免疫印迹(Western blotting)检测,分析RSV NS1在过表达细胞和病毒感染细胞中的表达与分布情况,评估该单抗在免疫沉淀反应中的应用价值。结果发现,RSV NS1蛋白在大肠杆菌中成功表达及纯化,免疫小鼠后,获得了一株特异性强、反应性好的RSV NS1单抗,其亚型为IgG1,且抗体效价可达1:15360000;使用该单抗鉴定出RSV NS1蛋白在转染和感染细胞中正常表达,IFA结果表明,NS1主要分布在细胞质与细胞核;并验证该单抗在免疫沉淀反应中作为捕获抗体能够特异性结合细胞中表达的NS1蛋白。本研究经原核表达系统成功获得RSV NS1蛋白,成功制备出抗RSV NS1单抗,该抗体能特异性识别NS1蛋白,可被应用于免疫沉淀方法,为NS1蛋白的功能研究奠定了基础。

关键词：呼吸道合胞病毒 NS1蛋白原核表达单克隆抗体免疫沉淀

乳房链球菌GapC蛋白的表达及其B细胞抗原表位的预测与鉴定

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生物工程学报 2022年第1期38卷 148-159页

作者：王汉青张雪静张欢陈晓萌张宝江苏艳新疆农业大学动物医学学院新疆乌鲁木齐830052

乳房链球菌Streptococcus uberis的GapC蛋白是一种位于该菌表面的具有甘油醛-3-磷酸脱氢酶活性的蛋白,其参与细胞活动,表现出多种生物学活性,此外还具有良好的抗原性。文中旨在对乳房链球菌GapC蛋白可能的B细胞抗原表位进行预测,分析和... 详细信息

乳房链球菌Streptococcus uberis的GapC蛋白是一种位于该菌表面的具有甘油醛-3-磷酸脱氢酶活性的蛋白,其参与细胞活动,表现出多种生物学活性,此外还具有良好的抗原性。文中旨在对乳房链球菌GapC蛋白可能的B细胞抗原表位进行预测,分析和验证候选表位肽的免疫原性。利用S. uberis分离株RF5-1克隆gapC基因,构建重组表达质粒pET-28a-GapC,诱导表达GapC重组蛋白,并以纯化蛋白免疫家兔,获得抗GapC多抗。利用生物信息学软件预测并分析GapCB细胞抗原表位的三维结构和空间位置及对GapC蛋白及表位的同源性比较。结果表明,表达纯化了44kDa的GapC蛋白具有良好的反应性。利用表位预测软件筛选并合成针对S.uberisGapC蛋白的6个线性和3个构象优势B细胞表位多肽,三维结构的分析显示,筛选的多肽具有良好的抗原表位形成条件。以纯化的S.uberis GapC蛋白免疫家兔制备多抗,通过间接ELISA对抗原表位进行鉴定。ELISA检测结果显示,9条抗原表位肽均可不同程度地与抗GapC多抗反应,其中表位^(266)AANDSYGYTEDPIVSSD^(282)与多抗反应水平显著高于其他表位。研究结果为深入了解S.uberis GapC蛋白的免疫学特性和利用其有效抗原表位奠定了基础。

关键词：乳房链球菌 GapC蛋白原核表达 B细胞表位表位多肽

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核盘菌角质酶的克隆、表达及活性分析

生物工程学报 2022年第1期38卷 386-395页

作者：吕蕊花史琳娜张喜荣冯昭陕西中医药大学医学技术学院陕西咸阳712046

角质酶可降解脂肪族或芳香族聚酯,对聚对苯二甲酸乙二醇酯也具有较好的降解作用,但目前市面上角质酶产品非常稀缺,因此寻求一种高效表达的角质酶用于工程酶的开发非常有必要。本研究从核盘菌中克隆得到8个角质酶基因,利用PCR结合RT-PCR... 详细信息

角质酶可降解脂肪族或芳香族聚酯,对聚对苯二甲酸乙二醇酯也具有较好的降解作用,但目前市面上角质酶产品非常稀缺,因此寻求一种高效表达的角质酶用于工程酶的开发非常有必要。本研究从核盘菌中克隆得到8个角质酶基因,利用PCR结合RT-PCR技术筛选出主效基因SsCut-52,利用大肠杆菌Escherichia coli BL21将SsCut-52进行异源表达并通过镍柱亲和层析的方法分离纯化,研究重组酶的特性及其致病性。SsCut-52全长为768 bp,N端有17个信号肽,进化树分析显示其氨基酸序列和葡萄孢属(Botrytis)角质酶同源性最高,和蜡盘菌属(Rutstroemia)角质酶亲缘关系也较近。SsCut-52在核盘菌侵染植物的过程中高效表达,在菌丝形成菌核的过程中表达量也高于其他角质酶基因。异源表达检测结果显示,角质酶以包涵体的形式存在,复性的SsCut-52在pH 6.0时活性最高,比活力达到3.45 U/mg,在pH为4.0–10.0时活性均较高。最适温度为20–30℃,当温度高于50℃时该酶的残余活性低于60%。植物叶片侵染结果表明,SsCut-52对核盘菌侵染板蓝根叶片具有一定的促进作用。

关键词：核盘菌角质酶硝基苯丁酸酯原核表达蛋白活性

基于接头序列“GSGGSG”的细粒棘球蚴病重组多表位疫苗EgG1Y162-2(4)的制备及鉴定

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中国血吸虫病防治杂志 2022年第4期34卷 378-382,416页

作者：郑佳张东军赵商岐李艳敏周彦霞周文涛周晓涛新疆医科大学基础医学院免疫学教研室新疆乌鲁木齐830054 山东省寄生虫病防治研究所、山东第一医科大学新疆医科大学第五附属医院

目的对细粒棘球蚴病重组多表位疫苗Eg G1Y162-2(4)进行原核表达并初步鉴定。方法利用免疫信息学方法对基于接头序列“GSGGSG”的细粒棘球蚴病重组多表位疫苗Eg G1Y162-2(4)进行三维结构建模,分析其结构变化并评估该疫苗抗原性。通过Eco ... 详细信息

目的对细粒棘球蚴病重组多表位疫苗Eg G1Y162-2(4)进行原核表达并初步鉴定。方法利用免疫信息学方法对基于接头序列“GSGGSG”的细粒棘球蚴病重组多表位疫苗Eg G1Y162-2(4)进行三维结构建模,分析其结构变化并评估该疫苗抗原性。通过Eco R I和SalⅠ双酶切构建p ET30a-EgG1Y162-2(4)重组质粒,将重组质粒转化入感受态细胞,利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG)诱导蛋白表达,Western blotting鉴定原核表达蛋白产物,并应用细粒棘球蚴病患者及健康人血清分析重组蛋白抗原性。结果构建的重组疫苗EgG1Y162-2(4)三维结构串联的4个Eg G1Y162-2蛋白均能独立、有效表达且具有良好抗原性。重组质粒pET30a-EgG1Y162-2(4)在0.2 mmol/L IPTG37℃诱导4 h条件下,上清中目的蛋白表达量最高,使用60 mmol/L咪唑洗脱的蛋白成分较纯。Western blotting分析发现,重组多表位蛋白HIS-EgG1Y162-2(4)在约39 k Da位置处出现条带,且该蛋白可被细粒棘球蚴病患者血清识别。结论成功构建了细粒棘球蚴重组疫苗EgG1Y162-2(4),为研究细粒棘球蚴病重组多表位疫苗奠定了基础。

关键词：细粒棘球蚴病接头序列多表位疫苗 EgG1Y162-2(4) 原核表达鉴定

芽孢杆菌发酵液的抑菌活性及葡聚糖酶的基因克隆、表达分析

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食品工业科技 2023年第8期44卷 144-152页

作者：孙紫文孟玉洁杨玉青王亚维张鑫付亚娟侯晓强廊坊师范学院生命科学学院河北廊坊065000 河北省食药用菌资源高值利用技术创新中心河北廊坊065000 河北省高校食药用菌资源开发应用技术研发中心河北廊坊065000

通过液培法和菌丝生长速率法,探究茯苓粉培养基(ABP培养基)诱导芽孢杆菌CmRh1产葡聚糖酶的发酵上清液对苹果炭疽病菌的抑制作用;采用PCR技术克隆葡聚糖内切酶基因,异源表达并初步验证其功能;采用在线生物信息学对芽孢杆菌葡聚糖酶的理... 详细信息

通过液培法和菌丝生长速率法,探究茯苓粉培养基(ABP培养基)诱导芽孢杆菌CmRh1产葡聚糖酶的发酵上清液对苹果炭疽病菌的抑制作用;采用PCR技术克隆葡聚糖内切酶基因,异源表达并初步验证其功能;采用在线生物信息学对芽孢杆菌葡聚糖酶的理化性质、信号肽、跨膜区、保守结构域、二级和三级结构、亚细胞定位等进行预测。结果表明:茯苓粉培养基(ABP培养基)诱导的芽孢杆菌CmRh1发酵上清液对苹果炭疽病菌具有一定的抑菌效果,抑菌率分别为16.07%和14.03%;从芽孢杆菌CmRh1菌株克隆到1个葡聚糖内切酶基因(Glu4),开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)为1500 bp,编码499 aa。生物信息学预测,Glu4是1个含有信号肽和1个跨膜结构域稳定的亲水性蛋白质,其分子量约为55 kDa,理论等电点为7.14;保守结构域预测,Glu4属于GH5型纤维素酶家族;二级结构元件主要包括α螺旋、延伸链、β转角和无规则卷曲,三级结构为典型的β-三明治结构,符合葡聚糖内切酶的结构特征;Glu4亚细胞定位于细胞外,是一个典型的分泌蛋白。SDSPAGE结合Western blot结果显示,Glu4能在大肠杆菌中表达,其蛋白大小与理论值55 kDa基本相符。重组工程菌具有分泌葡聚糖内切酶能力,为后期葡聚糖内切酶的纯化、酶学性质分析及探究Glu4对苹果炭疽病菌的抑菌活性奠定基础。

关键词：苹果炭疽病菌葡聚糖内切酶基因克隆原核表达抑菌活性

原核表达重组KLK7及其在胰腺癌细胞中的活性研究

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原核表达重组KLK7及其在胰腺癌细胞中的活性研究

作者：涂先聪三峡大学

学位级别：硕士

研究背景:综合国内外研究和课题组前期研究表明,组织激肽释放酶7(kallikrein-related peptidase 7,KLK7)可以促进胰腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力,抑制、沉默、敲低和敲除KLK7均可降低胰腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力,还可导致胰腺... 详细信息

研究背景:综合国内外研究和课题组前期研究表明,组织激肽释放酶7(kallikrein-related peptidase 7,KLK7)可以促进胰腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力,抑制、沉默、敲低和敲除KLK7均可降低胰腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力,还可导致胰腺癌细胞发生铁死亡。目的:在本研究中,采用原核表达、纯化出活性KLK7蛋白,并将其回补到KLK7缺失的胰腺癌细胞中,探究其对胰腺癌细胞功能的影响,为KLK7作为胰腺癌的潜在治疗靶点提供科学依据。方法:(1)利用分子克隆技术构建p GEX-6P-1-KLK7原核表达载体。(2)利用原核表达系统表达GST-KLK7蛋白。(3)采用GST亲和磁珠纯化GST-KLK7,随即采用肠激酶剪切GST,活化KLK7。(4)使用酶标法鉴定KLK7活性。(5)通过挽救实验验证KLK7蛋白在胰腺癌细胞中的活性功能:采用CCK8法、实时细胞检测技术和克隆形成实验评价KLK7活性蛋白对KLK7缺失的胰腺癌细胞株的增殖能力的影响;Western Blot实验检测回补KLK7活性蛋白对KLK7缺失引起的胰腺癌细胞铁死亡的逆转作用;采用划痕实验和Transwell实验评价回补KLK7活性蛋白对胰腺癌细胞迁移和侵袭能力的影响。结果:(1)成功构建p GEX-6P-1-KLK7原核表达载体。(2)成功利用原核表达系统表达GST-KLK7重组蛋白,并采用GST亲和磁珠纯化GST-KLK7重组蛋白,经剪切活化得到KLK7蛋白。(3)回补KLK7活性蛋白,可显著提高胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力。(4)回补KLK7活性蛋白能够在一定程度上逆转KLK7缺失造成的铁死亡。结论:本研究表明,原核表达出具有活性的KLK7蛋白可显著提高KLK7缺失的胰腺癌细胞PANC-1的增殖、迁移和侵袭的能力,且可逆转KLK7缺失引起的铁死亡,为KLK7作为胰腺癌的潜在治疗靶点提供科学依据。

关键词：组织激肽释放酶7 原核表达回补实验活性验证