花[魚骨]抗缪勒氏管激素基因克隆、抗体制备及其对外源雌激素的响应
Molecular cloning of anti-Müllerian hormone gene,polyclonal antibody preparation and response to exogenous estrogen in spotted steed(Hemibarbus maculatus Bleeker)作者机构：河南师范大学水产学院/河南省水产动物养殖工程技术研究中心河南新乡453007 河南省黄河流域伊洛河水生生物野外科学观测研究站河南郑州450000
出 版 物：《南方农业学报》 (Journal of Southern Agriculture)
年 卷 期：2022年第53卷第10期
页 面：2778-2786页
基 金：国家自然科学基金项目(31872199,U2004146) 河南省科技攻关重点项目(2121102110386) 河南省高等学校重点科研计划项目(21A240003)。
主 题：花[魚骨] 抗缪勒氏管激素 基因克隆 多克隆抗体 雌激素
摘 要：【目的】克隆花[魚骨]抗缪勒氏管激素基因Amh,分析其序列特征及亚细胞定位,检测不同浓度雌二醇处理下的表达变化规律,为后续研究Amh基因的功能及其在卵巢发育中分子机制提供理论参考。【方法】基于花[魚骨]转录组文库测序结果,克隆Amh基因cDNA序列,并对其进行生物信息学分析。构建重组表达质粒pET32a-Amh,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,用纯化的重组蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体。通过免疫荧光技术检测荧光信号确定蛋白的亚细胞定位情况。同时,利用实时荧光定量PCR检测Amh基因在雌二醇处理后的表达情况。【结果】克隆的花[魚骨]Amh基因cDNA序列全长为1849 bp,开放阅读框(ORF)为1671 bp,编码556个氨基酸残基。系统进化分析结果显示,花[魚骨]Amh基因与斑马鱼、鲤鱼等鲤科鱼类Amh基因聚为一支,表明其亲缘关系较近。将纯化的AMH重组蛋白免疫小鼠以制备AMH多克隆抗体,通过酶联免疫方法(ELISA)检测其抗体效价为2.4×106以上,Western blotting检测显示抗体具有特异性。AMH蛋白在花[魚骨]卵巢颗粒细胞表达。利用不同浓度的雌二醇处理花?60 d后发现,低浓度雌二醇(100μg/g)促进花?卵母细胞生长,卵巢内皮质液泡数量增多。经雌二醇处理后,卵巢中Amh基因的表达量降低,说明雌激素在卵巢发育中对Amh基因表达具有抑制作用。【结论】Amh基因含有TGF-β家族典型的结构域,在卵巢颗粒细胞表达,且响应雌激素的调控,可能在花?卵巢发育中发挥调控作用。
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